產(chǎn)品概述
比對(biwriter ) 2×SYBR Green PCR Master Mix 是采用 SYBR Green I 嵌合熒光法進(jìn)行 Real Time PCR 的專用試劑。含有常溫下完全封閉Taq 酶活性的熱啟動酶 HS Taq DNA
Polymerase,能夠有效抑制低溫條件下引物非特異性退火或者引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。本試劑經(jīng)過特殊配制，采用優(yōu)化配方的 qPCR 專用 Buffer
，大大提高了 qPCR 反應(yīng)的擴(kuò)增效率和檢測靈敏度，可以在較寬的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確進(jìn)行定量。本試劑與多數(shù)廠家的熒光定量 PCR 儀兼容，如Applied
Biosystems、Eppendorf、Bio-Rad 和Roche 等。
產(chǎn)品組成
A4004S
A4004M
2×SYBR Green PCR Master Mix
1ml
5×1ml
儲存條件：
本產(chǎn)品-20℃保存有效期至少一年，4℃可保存3個(gè)月。解凍后應(yīng)充分混勻，避免產(chǎn)生大量氣泡。避光保存。-20°C保質(zhì)期兩年。2-8°C保質(zhì)期三個(gè)月。避免反復(fù)凍融。
試劑原理：
本產(chǎn)品利用熱啟動酶HS Taq DNA polymerase 進(jìn)行 qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)，通過擴(kuò)增產(chǎn)物嵌合SYBR Green I 而激發(fā)的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行檢測。
1、 PCR
PCR 法是以微量 DNA 進(jìn)行目的片段擴(kuò)增的方法。通過 DNA 鏈的熱變性、引物退火、
DNA 聚合酶作用下引物的延伸三個(gè)步驟循環(huán)往復(fù)，可在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增大量 DNA 片段。
2、 熒光檢出
SYBR Green I 是一種結(jié)合與小溝中的雙鏈 DNA 結(jié)合染料，與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)，最大吸收波長約為 497nm，發(fā)射波長最大約為 520nm。
SYBR Green I 可以與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，無需使用探針，即可實(shí)現(xiàn)檢測，通用性好，且靈敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，因此由引物二聚
體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。在定量儀器檢測過程中，可以通過測量升高溫度后熒光的變化，由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性，從而
區(qū)分產(chǎn)物的溶解峰溫度而區(qū)分特異與非特異的產(chǎn)物。
使用方法：
反應(yīng)條件
1、 兩步法
熱啟動：95℃ 10 分鐘；
變 性：95℃ 10～20 秒；
退火/延伸：60℃ 20～60 秒。
溶解曲線分析。
2、 三步法
熱啟動：95℃ 10 分鐘；
變 性：95℃ 10～20 秒；
退 火 ：56-64℃ 10～30 秒
延 伸：72℃ 10～60 秒。溶解曲線分析。
對于 Roche LightCycler480，熱啟動時(shí)間應(yīng)采用 10min，ABI7500 也可以采用 5min 熱啟動。
qPCR反應(yīng)體系配制：
建議的模板量 10～100ng（基因組 DNA）或 1～10ng（cDNA 模板）。
試劑
20μl 體系
50μl 體系
終濃度
2×SYBR Green PCR Master Mix
10μl
25μl
1×
Primer 1（10μM）
0.4～2μl
1～5μl
0.2～1.0μM
Primer 2（10μM）
0.4～2μl
1～5μl
0.2～1.0μM
Template DNA
4μl
10μl
-
ddH2O
-
-
-
Total volume
20μl
50μl
注意事項(xiàng)：
1、 SYBR Green PCR Master Mix 經(jīng)過特殊配制，采用熱啟動酶，具有更高特異性；
2、 對于退火溫度較低的引物或超過 200bp 長片段擴(kuò)增建議采用三步法；
3、 擴(kuò)增前后要使用專用的區(qū)域和移液器，戴手套操作并經(jīng)常更換，PCR 反應(yīng)完成后切勿打開反應(yīng)管。以最大限度減少 PCR 產(chǎn)物對樣品的污染。
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