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ATP生物發(fā)光技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

   2024-12-23 www.eduienet.com2538
   ATP是化學物質(zhì)三磷酸腺苷的簡稱,存在于所有的生物體中(從微生物到高等動物),ATP在細胞體內(nèi)主要作用是提供能量。鑒于ATP存在于所有生物體中,利用ATP發(fā)光檢測儀檢測ATP,可以間接地證明生物體的存在。隨著食品行業(yè)對食品衛(wèi)生質(zhì)量要求越來越高,而且ATP生物發(fā)光法在檢測食品微生物時簡單、快速且靈敏度高,因此近年來受到廣泛關(guān)注。
 
1 ATP生物發(fā)光技術(shù)的發(fā)展過程
 
   ATP生物發(fā)光技術(shù)產(chǎn)生于20世紀70年代中期。1983年,Moyer[1]等最早提出細胞內(nèi)源性ATP的含量可以反映細胞的活性和活細胞的數(shù)量。同年Gronroos[2]等也證實該技術(shù)是一種可靠、靈敏度高的確定細胞活性度的檢測方法。20世紀80年代,英國人首先研制出ATP檢測儀檢測系統(tǒng),隨后發(fā)展到歐洲、美國和日本。應(yīng)用范圍涉及食品加工、超市和飲食行業(yè),檢測內(nèi)容包括微生物和食品殘渣。1998年,日本國會頒布了《關(guān)于食品制造過程管理高度化臨時措施法》,其中即包含了應(yīng)用ATP檢測儀檢測系統(tǒng)的內(nèi)容。1999年,日本還成立了ATP涂抹檢查研究會,專門研究該方法的使用效率和應(yīng)用領(lǐng)域,其內(nèi)容之一就是在食品衛(wèi)生監(jiān)測領(lǐng)域中,解決現(xiàn)場微生物的檢測問題。20世紀末,一些ATP檢測儀檢測系統(tǒng)及技術(shù)被引進我國,到目前為止,除個別省級衛(wèi)生監(jiān)督檢測單位裝備外,主要是在一些外資或合資企業(yè)中自行檢測使用。2002年,我國衛(wèi)生部頒發(fā)了食品加工企業(yè)HACCP實施指南,鼓勵食品加工企業(yè)引入ATP檢測系統(tǒng)。近年來,蟲熒光素酶已通過基因工程生產(chǎn),價格大幅度降低,隨著相關(guān)儀器的小型化,ATP生物發(fā)光技術(shù)必將會在國內(nèi)相關(guān)行業(yè)得到迅速普及[3] 。
 
2  ATP生物發(fā)光法菌落計數(shù)與傳統(tǒng)方法的比較
 
2.1  ATP生物發(fā)光法菌落計數(shù)
 
   ATP廣泛存在于各種活的生物體中,活的菌體中也含有ATP。細菌死亡后,在細胞內(nèi)酶的作用下,將很快被分解掉。ATP生物熒光檢測是基于生物發(fā)光體系的發(fā)光機理所設(shè)計,螢火蟲具有特殊的發(fā)光物質(zhì)——蟲熒光素及熒光素酶,熒光素易被氧化,它在熒光素酶催化下,由ATP激活,使之與氧結(jié)合,熒光素分子中的電子躍遷到高能級,處于不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài),當電子跳回到低能級時,即發(fā)出熒光光子。該光的強度與被檢測物質(zhì)中所含的ATP量成正比,利用高靈敏度的儀器測定光的強度進行定量分析。因此,通過測定樣品中ATP的濃度,即可推算出活菌數(shù)。生物發(fā)光法的檢測步驟大體包括:棉拭取樣、樣品萃取、添加熒光素和熒光素酶混合物、測定生物發(fā)光量、做出標準曲線、求出濃度和活菌數(shù)。通常,細菌表層有細胞膜和細胞壁包裹,故樣品未經(jīng)處理是不能測定的。測定時需先將樣品與微生物用提取試劑混合,使細胞膜和細胞壁開孔,提取出ATP提取試劑是以表面活性劑為基質(zhì)的專用試劑。然后,再與熒光素和熒光素酶生物發(fā)光試劑作用,用熒光儀測定與發(fā)光試劑反應(yīng)的生物發(fā)光量[4] 。

   這種方法可自動化操作,靈敏度高,可以達到10-12 mol/L;檢測速度快,相比表面皿培養(yǎng)法,僅需十幾分鐘就可以完成一個樣本的檢測;檢測范圍廣,此種方法不僅可以檢測微生物,還可以對食品生產(chǎn)設(shè)備的清潔度、酵母菌,乳酸菌等菌種的發(fā)酵活性等進行檢測。沈陽中科靚馬生物工程有限公司從中科院遺傳與發(fā)育所引進了“含蟲光素基因的新型菌株及蟲光素酶的生產(chǎn)方法”發(fā)明專利,成功研發(fā)了具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的“ATP熒光法細菌總數(shù)快速檢測系統(tǒng)”,系統(tǒng)采用了先進的ATP生物發(fā)光技術(shù),只要測定出相對熒光值,依據(jù)相對熒光值與細菌總數(shù)的標準曲線,幾分鐘內(nèi)即可快速得出樣品中的細菌總數(shù)[5] 。2008年周愛玉等對手持式ATP生物熒光檢測儀進行研制,取得了良好的結(jié)果[6] 。下圖即是兩款不同的類型,其中左側(cè)被稱之為掌上ATP發(fā)光法檢測儀,使檢測更加方便。(圖片均來自于互聯(lián)網(wǎng))

2.2 傳統(tǒng)菌落技術(shù)法
 
   菌落總數(shù)的測定,一般將被檢樣品制成幾個不同的10倍遞增稀釋液,然后從每個稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合,在一定溫度下,培養(yǎng)一定時間后(一般為48小時),記錄每個平皿中形成的菌落數(shù)量,依據(jù)稀釋倍數(shù),計算出每克(或每ml)原始樣品中所含細菌菌落總數(shù)。(以下圖片均來自于互聯(lián)網(wǎng))

3  ATP生物發(fā)光技術(shù)的應(yīng)用
 
   ATP生物發(fā)光法的應(yīng)用范圍十分廣泛,現(xiàn)已應(yīng)用于食品行業(yè)的多個領(lǐng)域。研究表明,ATP生物發(fā)光法與標準的細菌培養(yǎng)菌落計數(shù)法相比,二者具有良好的相關(guān)性(r=0.98) [7] ,但怎樣細分細菌種類有一定的難度,還需要做大量的工作。利用這種方法可以對食品原料、肉類、水產(chǎn)品、蔬菜、飲料、酒類、酸奶等中微生物的含量進行定量。此外,采用ATP生物發(fā)光法可快速、簡便地檢測食品生產(chǎn)環(huán)境的清潔度。對ATP 含量的檢測是以相對發(fā)光值(Relative Light Unit ,簡稱RLU)表示的。隨著RLU值的降低,微生物的檢出幾率也降低。實驗證明:如果將RLU值以100~1000作為界限,RLU值不滿100時,微生物檢出幾率為0,RLU值在100~1000范圍內(nèi)時,微生物檢出幾率為30%,RLU值超過1000時,微生物檢出幾率為96%。根據(jù)這一結(jié)果,在日常對食品生產(chǎn)設(shè)備或與食品密切接觸設(shè)備清潔度的檢測時,可以將RLU值不滿100時視為安全,RLU值在100~1000范圍內(nèi)時視為要引以重視和注意,RLU值超過1000時視為處于微生物污染的危險狀態(tài)[8] ,因此ATP 生物發(fā)光法十分適合HACCP系統(tǒng)的清潔度檢測。此外,還可以用于酵母菌等對毒素的敏感性比較[9] 。近年來,ATP生物發(fā)光技術(shù)在國內(nèi)外倍受推崇,在美、日等國食品行業(yè)的質(zhì)量檢測控制領(lǐng)域廣泛應(yīng)用,有效促進食品生產(chǎn)企業(yè)提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益,隨著此方法不斷改進和完善,生物發(fā)光法可望發(fā)展成為一種較為理想的微生物檢測方法而得到更廣泛的應(yīng)用,以不斷提高產(chǎn)品質(zhì)量,確保食品質(zhì)量安全。
 
參考文獻
 
[1] M JD, J H. Nucleoside triphosphate specificity of fireflyluciferase[J]. Analytical Biochemistry, 1983, 131(1): 187-189.
[2] GRONROOS M, MAENPAA J, NIEMINEN A L, et al. Correlation of steroid receptor contents with medroxyprogesterone and tamoxifen effects in endometrial cancer assayed by barin vitro ATP-bioluminescence method[J]. Journal of Steroid Biochemitry, 1983, 19(1): 194.
[3] 伍季,王燕,章建軍. ATP生物發(fā)光法快速檢測啤酒中的菌落總數(shù)[J]. 河南科學,2006,24 (1):63-65.
[4] 劉炳智,朱蓓. A T P 生物發(fā)光法在微生物檢驗上的應(yīng)用[J]. 預(yù)防醫(yī)學情報雜志,1999 ,(15 )1:29-30.
[5] 史帥. ATP 熒光法快檢系統(tǒng)實現(xiàn)細菌總數(shù)的快速檢測[J]. 食品安全導刊,2008,1:51-52.
[6] 周愛玉,羅金平,岳偉偉等. 手持式ATP 生物熒光檢測儀研制[J].2008,214:543-546.
[7] 舒柏華,孫丹陵,王勝利. 肉類食品細菌污染生物發(fā)光快速分析技術(shù)研究[J].中國公共衛(wèi)生,2003,19(4):483-484.
[8] 王茁. ATP 熒光微生物檢測法在食品衛(wèi)生監(jiān)控領(lǐng)域中的應(yīng)用與展望[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2004 ,16(3):266-267.
[9] S A, M-L D, P S. Use of ATP measurements by bioluminescence to quantify yeast's sensitivity against akiller toxin[J]. Analytica Chimica Acta, 2003, 495: 217-224.

 
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