蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)，變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀，在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀。
定性分析：
蛋白質(zhì)所形成的親水膠體顆粒具有兩種穩(wěn)定因素，即顆粒表面的水化層和電荷。若無(wú)外加條件，不致互相凝集。然而除掉這兩個(gè)穩(wěn)定因素(如調(diào)節(jié)溶液pH至等電點(diǎn)和加入脫水劑)蛋白質(zhì)便容易凝集析出。如將蛋白質(zhì)溶液pH調(diào)節(jié)到等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子呈等電狀態(tài)，雖然分子間同性電荷相互排斥作用消失了。但是還有水化膜起保護(hù)作用，一般不致于發(fā)生凝聚作用，如果這時(shí)再加入某種脫水劑，除去蛋白質(zhì)分子的水化膜，則蛋白質(zhì)分子就會(huì)互相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白質(zhì)脫水，然后再調(diào)節(jié)pH到等電點(diǎn)，也同樣可使蛋白質(zhì)沉淀析出。
沉淀方法：
1.鹽析法——多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化
在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱為鹽析。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。各種蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需的鹽濃度及pH不同，故可用于對(duì)混和蛋白質(zhì)組分的分離。例如用半飽和的硫酸銨來(lái)沉淀出血清中的球蛋白，飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出來(lái)，鹽析沉淀的蛋白質(zhì)，經(jīng)透析除鹽，仍保證蛋白質(zhì)的活性。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH至等電點(diǎn)后，再用鹽析法則蛋白質(zhì)沉淀的效果更好。鹽析法分為兩類(lèi)，第一類(lèi)叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過(guò)改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，用于早期的粗提液；第二種叫b分段鹽析法，在一定離子強(qiáng)度下通過(guò)改變PH和溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)，用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶。影響鹽析的因素包括：蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度和類(lèi)型、PH值、溫度等。針對(duì)溫度這一條，需要強(qiáng)調(diào)：在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質(zhì)、酶和多肽類(lèi)物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質(zhì)對(duì)鹽析溫度無(wú)特殊要求，可在室溫下進(jìn)行，只有某些對(duì)溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進(jìn)行。
使用硫酸銨沉淀蛋白需要注意：硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對(duì)蛋白質(zhì)巰基有敏感作用，使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H2S飽和，放置過(guò)夜，用濾紙除去重金屬離子，濃縮結(jié)晶，100℃烘干后使用。另外，高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性(PH=5.0左右)，使用前也需要用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需PH。
2.有機(jī)溶劑沉淀法——多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化；
有機(jī)溶劑的沉淀機(jī)理是降低水的介電常數(shù)，導(dǎo)致具有表面水層的生物大分子脫水，相互聚集，最后析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于：1)分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；2)沉淀不用脫鹽，過(guò)濾較為容易；3)在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。但是，在常溫下，有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此。因此，操作要求在低溫下進(jìn)行。有機(jī)溶劑的選擇首先是能和水混溶，使用較多的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。
3.等電點(diǎn)沉淀法——此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合使用；
兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時(shí)溶解度最低，不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。如工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時(shí)，在粗提液中先調(diào)PH8.0去除堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)PH3.0去除酸性蛋白質(zhì)。利用等電點(diǎn)除雜蛋白時(shí)必須了解制備物對(duì)酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險(xiǎn)。不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點(diǎn)會(huì)發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時(shí)，必須注意調(diào)整PH值。等電點(diǎn)法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。
附：沉淀血漿中各種溶劑以及去蛋白的效果<各種蛋白沉淀劑作用的比較>
| 名稱 |
上清液 |
0.5ml血漿中不同沉淀劑使蛋白沉淀的% | ||||||||
|
PH值 |
0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | |
| 10%三氯醋酸 | 1.4-2.0 |
99.7 |
99.3 |
99.6 |
99.5 |
99.5 |
99.7 |
99.8 |
99.8 |
99.8 |
| 6%高氯酸 | <1.5 |
35.4 |
98.3 |
98.9 |
99.1 |
99.1 |
99.2 |
99.2 |
99.1 |
99.0 |
| 5%磷酸 | 1.6-2.7 |
39.8 |
95.7 |
98.1 |
98.3 |
98.3 |
98.5 |
98.4 |
98.2 |
98.1 |
| 乙腈 | 8.5-9.5 |
13.4 |
14.8 |
45.8 |
88.1 |
97.2 |
99.4 |
99.7 |
99.8 |
99.8 |
| 丙酮 | 9-10 |
1.5 |
7.4 |
33.6 |
71.0 |
96.2 |
99.1 |
99.4 |
99.2 |
99.1 |
| 甲醇 | 8.5-9.5 |
17.6 |
17.4 |
32.2 |
41.3 |
73.4 |
97.9 |
98.7 |
98.9 |
99.2 |
| 乙醇 | 9-10 |
10.1 |
11.4 |
41.7 |
74.8 |
91.4 |
96.3 |
98.3 |
99.1 |
99.3 |
| Na2WO4-H2SO4 | 2.2-3.9 |
3.3 |
35.4 |
98.6 |
99.7 |
99.7 |
99.9 |
99.8 |
99.9 |
100 |
| CuSO4-Na2WO4 | 5.7-7.2 |
36.5 |
56.1 |
78.1 |
87.1 |
97.5 |
99.8 |
99.9 |
100 |
100 |
| ZnSO4-Ba(OH)2 | 6.6-8.3 |
45.6 |
80.7 |
93.5 |
89.2 |
93.3 |
97.0 |
99.3 |
99.6 |
99.8 |
| (NH4)2SO4(飽和) |
7.0-7.7 |
21.3 |
24.0 |
41.0 |
47.4 |
53.4 |
73.2 |
98.3 |
—— |
—— |
