早期細(xì)胞因子表達(dá)與細(xì)胞功能相關(guān)性研究是基于特定克隆">克隆細(xì)胞的激活。盡管研究應(yīng)用T淋巴細(xì)胞克隆">）與TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但這些研究很難外推，因?yàn)門細(xì)胞克隆"g克隆證明了不同細(xì)胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－>克隆與體內(nèi)T細(xì)胞功能相關(guān)性還未被揭示。

近來，Jung與Picker采用了monensin、PMA等藥物預(yù)孵，用Brefeldin（BFA）、Monensin阻斷了胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)的方法使得細(xì)胞因子聚集，蓄積，增強(qiáng)細(xì)胞因子信號可被流式細(xì)胞儀檢測。因?yàn)樽匀粻顟B(tài)下，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生少量的細(xì)胞因子，通常要對T淋巴細(xì)胞體外活化進(jìn)行研究。在體外刺激過程中，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子已釋放出來，胞內(nèi)細(xì)胞因子信號較弱，難以進(jìn)行檢測。這一方法可檢測單個細(xì)胞內(nèi)多個細(xì)胞因子，并可區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群。在細(xì)胞水平該方法證明了人與鼠的淋巴細(xì)胞都存在1型與2型分化，且這些分化在特定細(xì)胞因子增強(qiáng)時可被逆轉(zhuǎn)。且這些研究清楚地證明，只有激活的細(xì)胞亞群可以表達(dá)細(xì)胞因子，靜止的正常淋巴細(xì)胞（T、B、NK）不能分泌細(xì)胞因子。

胞內(nèi)流式分析法是用抗細(xì)胞因子抗體與細(xì)胞表面或胞內(nèi)特定亞群標(biāo)志組合，即可檢測不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的分泌，同時采用特殊的化學(xué)與抗體選擇，確保靜止與無細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的最小熒光背景。具有其它方法難以比擬的優(yōu)點(diǎn)：

快速：流式定量檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子可在一天內(nèi)完成，實(shí)驗(yàn)流程需6-8小時，實(shí)際操作時間為1-2小時，快速簡便；

簡便：無需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無需分離PBMCs；

靈敏度高：高度靈敏的熒光標(biāo)記與檢測系統(tǒng)；

高效：可以在同一個細(xì)胞內(nèi)同時檢測兩種或更多種細(xì)胞因子，也可根據(jù)細(xì)胞免疫表型區(qū)分分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞的亞型，進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)分析；

安全：減少樣本處理與生物源性污染

接近生物體的分析條件：全血檢測保留細(xì)胞及生化微環(huán)境更準(zhǔn)確反映了體內(nèi)狀況。

二、所需儀器

1、流式上樣管及細(xì)胞培養(yǎng)皿或板

2、25%CO₂，37℃孵箱

3、混勻振蕩器

4、離心機(jī)

5、加樣器、Tips

6、流式細(xì)胞儀

三、常用的標(biāo)本類型和處理方法

全血：使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素鋰、EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時內(nèi)分析，超過8小時會導(dǎo)致活性的損失，一般細(xì)胞因子陽性細(xì)胞會減少5%。如不能在8小時之內(nèi)檢測，應(yīng)將真空采血管水平室溫放置。

自身血漿中外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）：使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs，24小時內(nèi)分析。

組織培養(yǎng)基中的外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）：用Ficoll分離PBMCs，將細(xì)胞重懸于含10%熱滅活胎牛血清（FBS）的RPMI－1640培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106細(xì)胞/ml。

調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度2×106細(xì)胞/mL于新鮮培養(yǎng)基中。

冰凍全血與PBMCs：使用1×紅細(xì)胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重懸，－70℃凍存。溶化后細(xì)胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，離心5分鐘后，用破膜劑對細(xì)胞進(jìn)行破膜和染色。

四、所需試劑

1、細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑

依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇特殊表面標(biāo)志

CD45圈定所有淋巴細(xì)胞

CD3 圈定T淋巴細(xì)胞

CD4 圈定T輔助淋巴細(xì)胞亞群

CD8 圈定T抑制淋巴細(xì)胞亞群

CD19/或CD20圈定B淋巴細(xì)胞

CD56圈定NK淋巴細(xì)胞

CD14圈定單核細(xì)胞

2、熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體

R&D提供FITC、PE和APC標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體

3、溶血素

用外周全血檢測時需使用溶血素（R&D目錄號WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目錄號00-4333）溶解紅細(xì)胞

4、激活劑

① Phorbol 12-Myristate 13 Acetate（PMA）（Alexis，目錄號ALX-445-004-M001）

DMSO中調(diào)節(jié)濃度0.1mg/mL

L），－20℃儲存。勿反復(fù)凍融m分裝（20

每次實(shí)驗(yàn)用無菌無疊氮鈉PBS 1：100稀釋儲存液

D.PMA終濃度25ng/mL細(xì)胞懸液

② Ionomycin （Alexis，目錄號ALX-450-006-M001）

于乙醇中配制成濃度0.5mg/mL

－20℃儲存

每次實(shí)驗(yàn)用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液

g/mL細(xì)胞懸液m③Ionomycin終濃度1

Staphylococcal enterotoxin B（SEB） （Sigma，Catalog No.S-4881）

無菌無疊氮鈉PBS調(diào)節(jié)濃度0.5mg/mL

4℃儲存

g/mL細(xì)胞懸液mSEB終濃度10

④ CD3：包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑存在下活化未稀釋的血液細(xì)胞

⑤ CD28：加速不同刺激劑（包括SEB、CD3等）的活化效應(yīng)，濃度一般為10ug/ml

5、阻斷劑

阻斷高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使得刺激細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子聚集在胞漿內(nèi)

① Brefeldin-A（BFA） （eBioscience，目錄號00-4506）

于DMSO中調(diào)節(jié)濃度5mg/mL

分裝（20L），-20℃儲存。勿反復(fù)凍融。

每次實(shí)驗(yàn)用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液

g/mL細(xì)胞懸液。m激活最后4－5小時BFA終濃度10

注意：BFA過度孵育會導(dǎo)致細(xì)胞活力下降

② Monensin （eBioscience，目錄號00-4505）

6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640

7、 固定劑

細(xì)胞在體外刺激后需要對細(xì)胞進(jìn)行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細(xì)胞因子固定在細(xì)胞內(nèi)，另一方面避免細(xì)胞表面抗原丟失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目錄號00-8222）

8、 破膜劑

含1%皂甙、0.05%疊氮化鈉的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目錄號00-8333）

將細(xì)胞膜穿孔，已利于熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，于相應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合

9、其它試劑

無菌無疊氮鈉PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃儲存。

五、細(xì)胞培養(yǎng)和刺激的基本方法

細(xì)胞活化的最終結(jié)果是產(chǎn)生細(xì)胞因子，根據(jù)檢測指標(biāo)和標(biāo)本的不同，研究人員需要選擇不同的刺激劑和刺激時間，以獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下表提供了檢測一些常用細(xì)胞因子的推薦的活化方法。

表1、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式檢測推薦的陽性對照活化方法

為防止細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分泌到胞外，在培養(yǎng)的最后4-6個小時，需要使用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（如3uM monensin，10mg/ml的BFA）

方法1：只使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測

方法2：人的PBMCs使用PMA （10 ng/ml） 和Ionomycin （1 uM） 刺激4-24 小時.

方法3：人的PBMC 使用LPS （0.5 - 1 ug/ml） 刺激24 小時.

方法4：人的PBMCs或者純化的CD4＋細(xì)胞在包被人CD3抗體的培養(yǎng)板中，使用含有重組人的IL-2（10 ng/ml，目錄號202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目錄號204-IL-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；細(xì)胞洗滌后在含有重組人IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2天；最后收獲細(xì)胞，使用PMA（10 ng/ml） 和Ionomycin （1 uM）刺激6小時20mL于Falcon管中，加入100mL激活后的全血（細(xì)胞濃度維持在2×106/mL） 混勻，室溫暗處孵育15分鐘；

方法5： CD4 T 細(xì)胞使用PHA （10 ng/ml） 刺激4 days

方法6： T 細(xì)胞使用抗CD3 的單抗、抗CD28的單抗和重組人的IL-1b （Lorre, et al., 1994， Clin Immuno Immunopath 70:1）

方法7： 使用PMA （50 ng/ml） 和Ionomycin （500 ng/ml）刺激

 （10 ng/ml，目錄號285-IF-100） 刺激2 小時，然后使用IFN（10 ng/ml） LPS（1 ug/ml）刺激22小時或者使用相同的方法刺激THP-1 細(xì)胞.g方法8： PBMCs細(xì)胞使用重組人IFN

方法9： EL4 在包被抗小鼠CD3抗體（25 ug/ml）的培養(yǎng)板中，使用抗CD28抗體（2 ug/ml） PMA（5ng/ml） Ionomycin（500 ng/ml） 刺激6小時

方法10：CD4＋T細(xì)胞在包被小鼠CD3（25ug/ ml）抗體的培養(yǎng)板中，使用含有抗小鼠的CD28（2 ug/ml）的抗體，重組小鼠的IL-2（10 ng/ml，目錄號402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目錄號404-ML-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；然后在含有重組小鼠IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3天；最后收獲細(xì)胞，使用PMA（5 ng/ml）、Ionomycin（500 ng/ml）和monensin刺激6小時。

方法11： 小鼠ip巨噬細(xì)胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小時

方法12： 小鼠脾細(xì)胞使用PMA（5 ng/ml）和Ionomycin（500 ng/ml）刺激6小時

六、流式檢測細(xì)胞染色基本過程（以全血為例）

1、收獲細(xì)胞

肝素鈉抗凝的靜脈血，按1：1與培養(yǎng)基混勻，加刺激劑，同時加蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（參照說明書）， 混勻后，37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)4-6小時

2、阻斷Fc受體

用于消除非特異性的結(jié)合染色

① 在小鼠，可使用純化的FcII/III受體的抗體（CD16/32），按照1ug/106細(xì)胞的用量，在染色緩沖液中4℃孵育15分鐘，PBS清洗后，直接進(jìn)行下一步染色。

②對于人和大鼠，可直接使用過量的與熒光抗體相同來源和亞型不相關(guān)的純化Ig或者血清進(jìn)行阻斷

3、細(xì)胞表面染色

① 加適當(dāng)?shù)募?xì)胞表面染色試劑

② 加入溶血素，室溫暗處孵育10分鐘。（注意：PMA激活的全血可能會溶血不完全。）

③離心500g 5分鐘，棄上清

4、固定和破膜

① 加固定劑，室溫暗處孵育15分鐘，離心500g 5分鐘，棄上清；

② 加破膜劑溫暗處孵育10分鐘。（劑量參照說明書）

3mLPBS洗液，離心500g 5分鐘，棄上清。~③ 加2

5、細(xì)胞內(nèi)染色

① 加入熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體，混勻，室溫暗處孵育30分鐘。

LPBS上機(jī)或加入500 L 1% PFA固定后再上機(jī)m② 加2、3mL洗液，離心500g 5分鐘，棄上清，加入500

七、注意事項(xiàng)

1、標(biāo)本處理

避免使用絡(luò)合鈣的抗凝劑，如ACD與EDTA，因?yàn)樗鼈儠拗柒}依賴性激活過程，推薦用肝素鈉。此外LPS，一種常見的生物試劑污染物，是強(qiáng)細(xì)胞激活劑，可能會混淆試驗(yàn)結(jié)果。血樣在8小時內(nèi)分析，超過8小時會導(dǎo)致活性的損失，一般細(xì)胞因子陽性細(xì)胞會減少5%。如不能在8小時之內(nèi)檢測，應(yīng)將真空采血管水平室溫放置。

2、刺激激活

檢測不同的細(xì)胞因子根據(jù)情況選擇不同的刺激劑組合和刺激時間，以保證最佳的檢測效果。比如，要檢測IFN-γ則可選擇PMA和Ionomycin同時刺激；如果用CD4做表面標(biāo)記，由于多數(shù)病人的CD4抗原會因PMA的激活而有不同程度的下調(diào)，所以培養(yǎng)時間不能太長，4-6小時為宜，否則CD4下調(diào)影響分析

3、選擇合適的對照

為保證結(jié)合的真是和可靠性，至少熒光設(shè)置以下對照：

①未刺激對照

激活時由于BFA的存在抑制了胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此在激活過程中產(chǎn)生的抗原與細(xì)胞因子會滯留胞內(nèi)，未刺激對照也應(yīng)包含BFA。

② 激活對照

激活對照使用細(xì)胞表面表達(dá)CD69來評價激活與否，如果未達(dá)到CD69期望的水平，則激活步驟出了問題，某一試劑可能失活，過期，制備不當(dāng)或溶劑污染，需制備新鮮刺激劑重新實(shí)驗(yàn)。

③同型對照

使用與熒光標(biāo)記抗體相同來源、相同標(biāo)記、相同劑量和亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。

4、Fc受體阻斷

使用試劑阻斷Fc受體可以有效減少非特異熒光染色，在小鼠可以用純化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience， 目錄號14-0161-81），在大鼠可以用純化的抗大鼠的CD32，在人可以用過量的同種無關(guān)純化Ig或血清。

5、熒光素的選擇

檢測相對低表達(dá)細(xì)胞因子如IL-4時，應(yīng)選用PE或APC標(biāo)記；單檢測某一細(xì)胞因子時最好也選用PE或APC標(biāo)記；同時檢測多種細(xì)胞因子時，弱表達(dá)的應(yīng)選用PE或APC，F(xiàn)ITC標(biāo)記最好用于高表達(dá)細(xì)胞因子如IFN-γ。

八、問題與解答