目前檢測單個細胞特定細胞因子的表達手段包括：  ELIspot、原位雜交、免疫細胞化學、限制性稀釋分析（limiting dilution analysis，LDA）和單細胞PCR，應用原位雜交技術和免疫組化方法觀察細胞因子蛋白表達及mRNA表達可以識別Th1和Th2細胞，此方法可獲得較強的細胞內(nèi)信號，但此方法工作量大、主觀性強，難以進行大樣本檢測，且人肉眼識別能力有很大的局限性，而ELISPOT及單細胞PCR技術，技術性強、勞動強度大，難以進行廣泛推廣。隨著多標記及胞內(nèi)細胞因子標記流式細胞技術的出現(xiàn)，使對細胞內(nèi)細胞因子的研究推向了一個新的階段。下面主要對胞內(nèi)細胞因子流式細胞技術作以介紹。

早期細胞因子表達與細胞功能相關性研究是基于特定克隆">克隆細胞的激活。盡管研究應用T淋巴細胞克隆">）與TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但這些研究很難外推，因為T細胞克隆"g克隆證明了不同細胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－>克隆與體內(nèi)T細胞功能相關性還未被揭示。

近來，Jung與Picker采用了monensin、PMA等藥物預孵，用Brefeldin（BFA）、Monensin阻斷了胞內(nèi)高爾基體介導的轉運的方法使得細胞因子聚集，蓄積，增強細胞因子信號可被流式細胞儀檢測。因為自然狀態(tài)下，T淋巴細胞產(chǎn)生少量的細胞因子，通常要對T淋巴細胞體外活化進行研究。在體外刺激過程中，T淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子已釋放出來，胞內(nèi)細胞因子信號較弱，難以進行檢測。這一方法可檢測單個細胞內(nèi)多個細胞因子，并可區(qū)分表達特定細胞因子的細胞亞群。在細胞水平該方法證明了人與鼠的淋巴細胞都存在1型與2型分化，且這些分化在特定細胞因子增強時可被逆轉。且這些研究清楚地證明，只有激活的細胞亞群可以表達細胞因子，靜止的正常淋巴細胞（T、B、NK）不能分泌細胞因子。

胞內(nèi)流式分析法是用抗細胞因子抗體與細胞表面或胞內(nèi)特定亞群標志組合，即可檢測不同細胞亞群細胞因子的分泌，同時采用特殊的化學與抗體選擇，確保靜止與無細胞因子分泌細胞的最小熒光背景。具有其它方法難以比擬的優(yōu)點：

快速：流式定量檢測細胞內(nèi)細胞因子可在一天內(nèi)完成，實驗流程需6-8小時，實際操作時間為1-2小時，快速簡便；

簡便：無需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無需分離PBMCs；

靈敏度高：高度靈敏的熒光標記與檢測系統(tǒng)；

高效：可以在同一個細胞內(nèi)同時檢測兩種或更多種細胞因子，也可根據(jù)細胞免疫表型區(qū)分分泌細胞因子的細胞的亞型，進行多參數(shù)相關分析；

安全：減少樣本處理與生物源性污染

接近生物體的分析條件：全血檢測保留細胞及生化微環(huán)境更準確反映了體內(nèi)狀況。

二、所需儀器

1、流式上樣管及細胞培養(yǎng)皿或板

2、25%CO₂，37℃孵箱

3、混勻振蕩器

4、離心機

5、加樣器、Tips

6、流式細胞儀

三、常用的標本類型和處理方法

全血：使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素鋰、EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時內(nèi)分析，超過8小時會導致活性的損失，一般細胞因子陽性細胞會減少5%。如不能在8小時之內(nèi)檢測，應將真空采血管水平室溫放置。

自身血漿中外周血單個核細胞（PBMCs）：使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs，24小時內(nèi)分析。

組織培養(yǎng)基中的外周血單個核細胞（PBMCs）：用Ficoll分離PBMCs，將細胞重懸于含10%熱滅活胎牛血清（FBS）的RPMI－1640培養(yǎng)基中，調節(jié)細胞濃度為2×106細胞/ml。

調節(jié)細胞濃度2×106細胞/mL于新鮮培養(yǎng)基中。

冰凍全血與PBMCs：使用1×紅細胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重懸，－70℃凍存。溶化后細胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，離心5分鐘后，用破膜劑對細胞進行破膜和染色。

四、所需試劑

1、細胞表面染色的熒光標記的單抗試劑

依據(jù)實驗需要選擇特殊表面標志

CD45圈定所有淋巴細胞

CD3 圈定T淋巴細胞

CD4 圈定T輔助淋巴細胞亞群

CD8 圈定T抑制淋巴細胞亞群

CD19/或CD20圈定B淋巴細胞

CD56圈定NK淋巴細胞

CD14圈定單核細胞

2、熒光標記的細胞因子抗體

R&D提供FITC、PE和APC標記的細胞因子抗體

3、溶血素

用外周全血檢測時需使用溶血素（R&D目錄號WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目錄號00-4333）溶解紅細胞

4、激活劑

① Phorbol 12-Myristate 13 Acetate（PMA）（Alexis，目錄號ALX-445-004-M001）

DMSO中調節(jié)濃度0.1mg/mL

L），－20℃儲存。勿反復凍融m分裝（20

每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：100稀釋儲存液

D.PMA終濃度25ng/mL細胞懸液

② Ionomycin （Alexis，目錄號ALX-450-006-M001）

于乙醇中配制成濃度0.5mg/mL

－20℃儲存

每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液

g/mL細胞懸液m③Ionomycin終濃度1

Staphylococcal enterotoxin B（SEB） （Sigma，Catalog No.S-4881）

無菌無疊氮鈉PBS調節(jié)濃度0.5mg/mL

4℃儲存

g/mL細胞懸液mSEB終濃度10

④ CD3：包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉運抑制劑存在下活化未稀釋的血液細胞

⑤ CD28：加速不同刺激劑（包括SEB、CD3等）的活化效應，濃度一般為10ug/ml

5、阻斷劑

阻斷高爾基體介導的轉運作用，使得刺激細胞表達的細胞因子聚集在胞漿內(nèi)

① Brefeldin-A（BFA） （eBioscience，目錄號00-4506）

于DMSO中調節(jié)濃度5mg/mL

分裝（20L），-20℃儲存。勿反復凍融。

每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液

g/mL細胞懸液。m激活最后4－5小時BFA終濃度10

注意：BFA過度孵育會導致細胞活力下降

② Monensin （eBioscience，目錄號00-4505）

6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640

7、 固定劑

細胞在體外刺激后需要對細胞進行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細胞因子固定在細胞內(nèi)，另一方面避免細胞表面抗原丟失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目錄號00-8222）

8、 破膜劑

含1%皂甙、0.05%疊氮化鈉的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目錄號00-8333）

將細胞膜穿孔，已利于熒光標記的細胞因子抗體進入細胞內(nèi)，于相應的細胞因子結合

9、其它試劑

無菌無疊氮鈉PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃儲存。

五、細胞培養(yǎng)和刺激的基本方法

細胞活化的最終結果是產(chǎn)生細胞因子，根據(jù)檢測指標和標本的不同，研究人員需要選擇不同的刺激劑和刺激時間，以獲得最佳的實驗結果。下表提供了檢測一些常用細胞因子的推薦的活化方法。

表1、細胞內(nèi)細胞因子流式檢測推薦的陽性對照活化方法

為防止細胞內(nèi)細胞因子分泌到胞外，在培養(yǎng)的最后4-6個小時，需要使用蛋白轉運抑制劑（如3uM monensin，10mg/ml的BFA）

方法1：只使用轉染細胞檢測

方法2：人的PBMCs使用PMA （10 ng/ml） 和Ionomycin （1 uM） 刺激4-24 小時.

方法3：人的PBMC 使用LPS （0.5 - 1 ug/ml） 刺激24 小時.

方法4：人的PBMCs或者純化的CD4＋細胞在包被人CD3抗體的培養(yǎng)板中，使用含有重組人的IL-2（10 ng/ml，目錄號202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目錄號204-IL-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；細胞洗滌后在含有重組人IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2天；最后收獲細胞，使用PMA（10 ng/ml） 和Ionomycin （1 uM）刺激6小時20mL于Falcon管中，加入100mL激活后的全血（細胞濃度維持在2×106/mL） 混勻，室溫暗處孵育15分鐘；

方法5： CD4 T 細胞使用PHA （10 ng/ml） 刺激4 days

方法6： T 細胞使用抗CD3 的單抗、抗CD28的單抗和重組人的IL-1b （Lorre, et al., 1994， Clin Immuno Immunopath 70:1）

方法7： 使用PMA （50 ng/ml） 和Ionomycin （500 ng/ml）刺激

 （10 ng/ml，目錄號285-IF-100） 刺激2 小時，然后使用IFN（10 ng/ml） LPS（1 ug/ml）刺激22小時或者使用相同的方法刺激THP-1 細胞.g方法8： PBMCs細胞使用重組人IFN

方法9： EL4 在包被抗小鼠CD3抗體（25 ug/ml）的培養(yǎng)板中，使用抗CD28抗體（2 ug/ml） PMA（5ng/ml） Ionomycin（500 ng/ml） 刺激6小時

方法10：CD4＋T細胞在包被小鼠CD3（25ug/ ml）抗體的培養(yǎng)板中，使用含有抗小鼠的CD28（2 ug/ml）的抗體，重組小鼠的IL-2（10 ng/ml，目錄號402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目錄號404-ML-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；然后在含有重組小鼠IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3天；最后收獲細胞，使用PMA（5 ng/ml）、Ionomycin（500 ng/ml）和monensin刺激6小時。

方法11： 小鼠ip巨噬細胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小時

方法12： 小鼠脾細胞使用PMA（5 ng/ml）和Ionomycin（500 ng/ml）刺激6小時

六、流式檢測細胞染色基本過程（以全血為例）

1、收獲細胞

肝素鈉抗凝的靜脈血，按1：1與培養(yǎng)基混勻，加刺激劑，同時加蛋白轉運抑制劑（參照說明書）， 混勻后，37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)4-6小時

2、阻斷Fc受體

用于消除非特異性的結合染色

① 在小鼠，可使用純化的FcII/III受體的抗體（CD16/32），按照1ug/106細胞的用量，在染色緩沖液中4℃孵育15分鐘，PBS清洗后，直接進行下一步染色。

②對于人和大鼠，可直接使用過量的與熒光抗體相同來源和亞型不相關的純化Ig或者血清進行阻斷

3、細胞表面染色

① 加適當?shù)募毎砻嫒旧噭?/FONT>