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新時代即將被開啟 電子顯微鏡技術(shù)的最新突破

   2024-12-23 中國顯微圖像網(wǎng)1374

  近日,美國勞倫斯伯克利國家實驗室(LawrenceBerkeleyNationalLab)的一則新聞(http://newscenter.lbl.gov/feature-stories/2012/01/24/3d-protein/)引起了世界范圍內(nèi)的密切關(guān)注,相關(guān)的報道被一百多家國際新聞機(jī)構(gòu)廣泛轉(zhuǎn)載和評論。該新聞報道了一篇最新發(fā)表的關(guān)于測定單個蛋白分子三維空間結(jié)構(gòu)方法的論文。論文的兩名作者分別是勞倫斯伯克利國家實驗室研究員任罡博士和張磊博士(任罡博士研究小組博士后http://foundry.lbl.gov/rengroup/index.html)。為了證明該方法的實用性,他們分別測定了人體抗體蛋白以及高密度脂蛋白的單個分子的三維密度圖,并取得了迄今為止最高分辨率的單個蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)。這一結(jié)論,打破了近半個世紀(jì)以來人類科研史上“單個蛋白分子的有效三維結(jié)構(gòu)不可能獲得”的偏見。該方法有望成為解決多形態(tài)的蛋白分子結(jié)構(gòu)測定難題的基本方法。該方法通過對逐個確定的單個蛋白三維結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行比較,來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)關(guān)節(jié),而這些結(jié)構(gòu)關(guān)節(jié)的信息對生物藥物的結(jié)構(gòu)設(shè)計有著及其重大的意義。

  一般而言,對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定,主要的科研方法包括X光衍射法、核磁共振譜法,以及傳統(tǒng)的單顆粒電鏡重構(gòu)。但這些方法需要獲取成千上萬的結(jié)構(gòu)全同的蛋白質(zhì)分子的平均信號或圖像來完成,受蛋白質(zhì)是否結(jié)晶、分子量過大或結(jié)構(gòu)是否單一等條件制約,科研人員無法獲得任意單個蛋白質(zhì)個體分子的三維結(jié)構(gòu),從而無法獲得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)關(guān)節(jié)信息,直接影響對與之密切相關(guān)的功能理解。任罡和張磊博士發(fā)展了一套測定任意單個蛋白質(zhì)個體分子的三維結(jié)構(gòu)方法,稱之為“Individual-ParticleElectronTomography(單個體蛋白電子斷層成像技術(shù),即IPET)”。這是一種利用電子顯微斷層成像技術(shù)有機(jī)地結(jié)合獨立開發(fā)的三維結(jié)構(gòu)重構(gòu)算法研究蛋白質(zhì)個體分子結(jié)構(gòu)的技術(shù)。該項技術(shù)的論文發(fā)表在2012年1月24日出版的PLoSONE期刊,題目為《IPETandFETR:ExperimentalApproachforStudyingMolecularStructureDynamicsbyCryo-ElectronTomographyofaSingle-MoleculeStructure》。

  該論文詳細(xì)描述了IPET的流程細(xì)節(jié)和重構(gòu)算法具體步驟,陳述了可以突破電子斷層成像方法重構(gòu)的分辨率極限理論證據(jù),并分析了各種實驗誤差影響和探討了傳統(tǒng)算法的局限性及其對三維重構(gòu)分辨率的影響,從而證明了傳統(tǒng)所認(rèn)為的“單個蛋白分子信號不足以重構(gòu)有結(jié)構(gòu)意義的三維空間密度圖”這一觀點的片面性。為了證明該方法對真實實驗圖像處理的實用性,任罡和張磊博士在實驗中對兩種蛋白質(zhì)的四個單獨的個體分子進(jìn)行了迄今為止最高分辨率的三維結(jié)構(gòu)測定。該研究成果被多名專家評價為具有開拓性的方法論,而論文的發(fā)表對蛋白個體分子的三維結(jié)構(gòu)測定和蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)的研究具有里程碑式的意義。

  任罡博士自1990年開始師從我國著名的理論物理學(xué)家段一士教授于蘭州大學(xué)物理系攻讀碩士學(xué)位,自1993年師從我國著名的高分辨電子顯微學(xué)創(chuàng)始人、準(zhǔn)晶體的獨立發(fā)現(xiàn)人之一的郭可信院士于北京科技大學(xué)材料物理系攻讀博士學(xué)位。攻讀博士學(xué)位期間,任罡博士同時跟隨從英國劍橋大學(xué)留學(xué)歸國的彭練矛教授(北大教授、國際電子晶體學(xué)學(xué)會會長)從事博士論文及相關(guān)的科研工作。

  此期間的學(xué)習(xí)和獲得的培訓(xùn)使任罡博士具備了堅實的高分辨電子顯微學(xué)理論基礎(chǔ)和實驗技巧。1997年任罡博士赴美,在美國加州圣地亞哥Scripps研究所細(xì)胞生物學(xué)系的AlokMitra研究小組從事AQP1水通道膜蛋白的電子晶體學(xué)博士后研究;在2001年初測定了該水通道膜蛋白的原子結(jié)構(gòu),該項研究對2003年獲諾貝爾化學(xué)獎的研究工作給予了有力支持,引起轟動,并被科學(xué)時報等新聞媒體廣泛報道。

  2006年任罡博士在美國加州大學(xué)舊金山分校成立了自己的獨立研究小組,主攻人體脂蛋白結(jié)構(gòu)的冷凍電子顯微鏡研究。在此期間,他曾利用單顆粒平均方法獲取了低密度脂蛋白的三維結(jié)構(gòu),該成果引起了業(yè)內(nèi)廣泛關(guān)注,相關(guān)的論文被發(fā)表于2010年的PNAS期刊。自2008年底張磊博士的加入開始,任罡博士科研小組將研究方向轉(zhuǎn)向了單個蛋白質(zhì)個體分子的三維重構(gòu)方法論,力圖攻克高動態(tài)性蛋白的結(jié)構(gòu)研究瓶頸。任罡和張磊博士憑借出色的電子顯微鏡操作技術(shù)、堅實的物理學(xué)背景、嫻熟的數(shù)學(xué)技巧和計算機(jī)編程能力,以及夜以繼日的勤奮工作,使研究取得了突破性的進(jìn)展。不僅首次從實驗中獲得了分子量極低(小于200kDa)、尺寸極小(小于20nm)的人體高密度脂蛋白的冷凍電鏡電子斷層像;而且利用自主開發(fā)的計算機(jī)算法,極大地降低了圖像的噪聲水平,在人類對蛋白質(zhì)研究歷史上,首次獲得了單個分子的高分辨的三維重構(gòu)圖。

  與光波波長相比,電子的波長更短,使得利用電子成像的透射電子顯微鏡可以觀察到原子水平的物質(zhì)細(xì)節(jié)。任罡博士科研小組主要利用冷凍電鏡技術(shù),在零下180度左右的低溫下制備并檢測樣品。在此溫度下,液態(tài)樣品會被快速冷凍到非晶態(tài)冰狀態(tài),樣品最終被固定在直徑約3毫米的金屬網(wǎng)上非晶碳膜的孔洞中,然后被快速放置于電鏡真空腔內(nèi)。斷層掃描像是通過傾轉(zhuǎn)(如從70°到-70°,以1°間隔傾轉(zhuǎn))取得整個樣品。由于蛋白質(zhì)的尺寸極小,為了保證成像區(qū)域在整個過程中不會偏離,電鏡的各種參數(shù)必須進(jìn)行精確的調(diào)制。“這就好比將要轉(zhuǎn)動的樣品載體放大到整個地球一樣的大小,你要跟蹤觀察的蛋白的尺寸就如地球上的一個戒指大小,而照相的過程就像在操作整個地球的轉(zhuǎn)動,必須保證地球上的這個戒指大小的物體始終保持在觀察視野的中心?!比晤覆┦咳缡钦f。在成像過程中,機(jī)械的震動、環(huán)境的噪音、溫度的變化,甚至包括冷凍槽中維持低溫用的液氮中的氣泡的震動,都要被最大限度地降低,將其引起的機(jī)械誤差控制在一個微米的范圍內(nèi)才有可能得到一套完整的數(shù)據(jù)。

  液氮低溫不僅可以使蛋白樣品被固定在非晶態(tài)冰中保持其在自然中的結(jié)構(gòu)狀態(tài),還可以使樣品在低電子輻照下更好地成像,從而保證蛋白在大約1-2個小時的傾轉(zhuǎn)成像過程中完好無損。

  對單個蛋白結(jié)構(gòu)的確定,使得人們可以通過觀察同一種蛋白質(zhì)的不同形態(tài),得到該種蛋白在自然狀態(tài)下的動態(tài)關(guān)節(jié);更使得人類研究生物大分子的活性以及結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系成為可能。為證實這一可能,任罡和張磊博士對兩個IgG抗體的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較,并利用電腦動畫進(jìn)行了演示,此動畫顯示了抗體一號的三個分子集團(tuán)如何動態(tài)地變化到抗體二號的狀態(tài)。

  “這好比打開了一道門——一道通往研究蛋白動態(tài)性的大門,”任罡博士說,“IPET算法的發(fā)表,以及我們正在著手準(zhǔn)備的一系列IPET應(yīng)用的文章,無疑將標(biāo)志著電子顯微鏡在生物大分子動態(tài)形態(tài)結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域的一場革命的開始。一個新時代即將被開啟!”

 
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