常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類,一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(永久轉(zhuǎn)染).前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析.一般來說,超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高,在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)(依賴于各種不同的構(gòu)建)分析結(jié)果,常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來幫助檢測(cè).后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體(episome)存在.盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高.外源DNA整合到染色體中概率很小,大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合,通常需要通過一些選擇性標(biāo)記,如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反復(fù)篩選,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。
轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大,許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例,細(xì)胞數(shù)量,培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等.一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù),如DEAE右旋糖苷法,磷酸鈣法,電穿孔法,脂質(zhì)體法各有利弊,其主要原理及應(yīng)用特點(diǎn)如下:
磷酸鈣法
磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 不適用于原代細(xì)胞
操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差
有些細(xì)胞不適用
瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 不適用于原代細(xì)胞
操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差
有些細(xì)胞不適用
DEAE-右旋糖苷法
帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 相對(duì)簡(jiǎn)便、結(jié)果可重復(fù) 但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用 轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清
帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 相對(duì)簡(jiǎn)便、結(jié)果可重復(fù) 但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用 轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清
電穿孔法
高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位,DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染
所有細(xì)胞 適用性廣但細(xì)胞致死率高,DNA和細(xì)胞用量大, 需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件
高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位,DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染
所有細(xì)胞 適用性廣但細(xì)胞致死率高,DNA和細(xì)胞用量大, 需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件
病毒介導(dǎo)法
通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞,體內(nèi)細(xì)胞等
通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞,體內(nèi)細(xì)胞等
逆轉(zhuǎn)錄病毒
特定宿主細(xì)胞 但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期 需考慮安全因素
特定宿主細(xì)胞 但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期 需考慮安全因素
腺病毒
通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 特定宿主細(xì)胞 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞
需考慮安全因素
需考慮安全因素
陽離子脂質(zhì)體法 帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染
所有細(xì)胞 適用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,重復(fù)性好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清.轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大
所有細(xì)胞 適用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,重復(fù)性好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清.轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大
Biolistic顆粒傳遞法
將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞,DNA在胞內(nèi)逐步釋放,表達(dá) 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 可用于:人的表皮細(xì)胞,纖維原細(xì)胞,淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞
將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞,DNA在胞內(nèi)逐步釋放,表達(dá) 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 可用于:人的表皮細(xì)胞,纖維原細(xì)胞,淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞
顯微注射法
用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限
多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞
用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限
多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞
各種轉(zhuǎn)染方法的比較:
除上述傳統(tǒng)方法外,近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù),以其適用宿主范圍廣,操作簡(jiǎn)便,對(duì)細(xì)胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞.其中樹枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)的轉(zhuǎn)染性能最佳,但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性,且其合成工藝復(fù)雜.聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機(jī)大分子,每相隔二個(gè)碳個(gè)原子,即每“第三個(gè)原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子,使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(proton sponge)體.這種聚陽離子能將各種報(bào)告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞,其效果好于脂質(zhì)聚酰胺,經(jīng)進(jìn)一步的改性后,其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物,而且它的細(xì)胞毒性低.大量實(shí)驗(yàn)證明,PEI是非常有希望的基因治療載體.目前在設(shè)計(jì)更復(fù)雜的基因載體時(shí),PEI經(jīng)常做為核心組成成分。
除上述傳統(tǒng)方法外,近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù),以其適用宿主范圍廣,操作簡(jiǎn)便,對(duì)細(xì)胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞.其中樹枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)的轉(zhuǎn)染性能最佳,但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性,且其合成工藝復(fù)雜.聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機(jī)大分子,每相隔二個(gè)碳個(gè)原子,即每“第三個(gè)原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子,使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(proton sponge)體.這種聚陽離子能將各種報(bào)告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞,其效果好于脂質(zhì)聚酰胺,經(jīng)進(jìn)一步的改性后,其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物,而且它的細(xì)胞毒性低.大量實(shí)驗(yàn)證明,PEI是非常有希望的基因治療載體.目前在設(shè)計(jì)更復(fù)雜的基因載體時(shí),PEI經(jīng)常做為核心組成成分。
線型PEI(Line PEI,LPEI)與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI(Branched PEI,BPEI)要早一些,過去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件,LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低,有利于細(xì)胞定位,因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些.但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物,從而提高轉(zhuǎn)染效率,但同時(shí)細(xì)胞毒性也增大.超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基,在染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低,但轉(zhuǎn)染效率卻較高。
GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理?xiàng)l件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián),合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物.聚合物的分枝結(jié)構(gòu)使得其具有較高的正電性,因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒,從而提高轉(zhuǎn)染效率,當(dāng)所形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞以后,其中所含的生理?xiàng)l件下可降解的化學(xué)鍵在細(xì)胞內(nèi)水解,使交聯(lián)聚合物分解為無細(xì)胞毒性的小分子PEI,這樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑在體外應(yīng)用可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性,其可降解性對(duì)體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。