Celigo細胞分析儀可分析生長在微孔板和T-flask中的貼壁和非貼壁（懸?。┘毎?，具有超越傳統(tǒng)方法的更好的優(yōu)勢。Celigo具有特別一致的，高質(zhì)量，全孔的明亮視野（brightfield）成像功能，結合強大的分割軟件可在5分鐘內(nèi)獲得整個微孔板的所有孔中的所有細胞的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。Celigo具有非破壞性和非侵入性明亮視野分析功能，并有多色熒光功能作補充，使系統(tǒng)適合任何實驗室中的基于細胞的廣泛的實驗。

圖1 Celigo細胞分析儀

Celigo細胞分析儀具有下列特征和優(yōu)勢：

1）可接受T-flask（T-25和T-75）和多數(shù)微孔板（1536孔板到6孔板）；

2）可在整個孔的范圍內(nèi)進行準確的明亮視野細胞成像和識別；

3）具有三通道熒光（除了明亮視野功能）：紅色熒光、綠色熒光和藍色熒光；

4）極快速的掃描（掃描整塊微孔板大約耗時5-15min）；

5）有直觀并易于使用的，功能強大的，軟件分割和分類界面；

6）可選擇的API軟件，可進行機械臂裝載整合。

 

Celigo細胞分析儀的杰出的性能主要取決于它的獨特的光學通路，此光學通路應用了一個大型的F-theta透鏡和檢流計鏡片來進行大面積快速掃描。與傳統(tǒng)的基于顯微鏡的儀器不同，此系統(tǒng)可掃描整個孔，而無需移動微孔板，并保持一致的亮度對孔邊緣的細胞進行準確的細胞識別。

 

Celigo可檢測的細胞分析參數(shù)：

1）總細胞數(shù)目（Total Cell Number）；2）分類細胞數(shù)目（Gated Cell Number）；3）分類細胞百分比（Percentage of Gated Cells）；4）細胞密度（Cell Density）；5）細胞面積（Cell Area）；6）細胞平均強度（Cell Mean Intensity）；7）細胞累積強度（Cell Integrated Intensity）；8）細胞長寬比（Cell Aspect Ratio）；9）細胞形狀因子（Cell Form Factor）；10）細胞光滑度（Cell Smoothness）；11）克隆直徑（Colony Diameter）；12）克隆周長（Colony Perimeter）。

 

Celigo細胞分析儀的應用

（一）明亮視野無標記實驗

1）細胞計數(shù)和細胞生長跟蹤（Cell Counting & Growth Tracking）

用于進行細胞系特征描述，克隆確認，和基于形態(tài)學的篩選。

2）克隆計數(shù)：球體分析（Colony Counting: Sphere Analysis）

用于進行EB特征描述和腫瘤球體分析。

3）飽和度（Confluency）

用于細胞系特征描述和侵染性實驗。

（二）熒光標記實驗

1）細胞計數(shù)和細胞生長跟蹤（Cell Counting & Growth Tracking）

用于進行細胞系特征描述，克隆確認，和基于形態(tài)學的篩選。

2）細胞分泌實驗（Cell Secretion Assay）

用于細胞分泌分析。

3）細胞活力（Cell Viability）

用于方法學發(fā)展，細胞健康性實驗和高通量篩選。

4）DNA合成（DNA Synthesis）

用于細胞周期分析，細胞健康性實驗，高通量篩選和細胞增殖實驗。

5）表達分析（Expression Analysis）

用于細胞信號，高通量篩選，標記分析和轉染優(yōu)化。

6）磷脂酰絲氨酸外部化（Phosphatidylserine Externalization）

用于方法學發(fā)展，細胞健康性實驗和高通量篩選。

 

應用詳述：

（一）細胞計數(shù)（Cell Counting）

Celigo的細胞計數(shù)應用，描述了全孔非標記明亮視野成像的特征，極大地提高了細胞培養(yǎng)物中計數(shù)的準確性，并且消除了過去需要分離酶和血細胞計數(shù)器才能確定細胞培養(yǎng)密度的狀況。Celigo細胞計數(shù)應用的靈活性和易于使用性也可以監(jiān)控隨時間的細胞生長，并方便對培養(yǎng)的日常管理。這個過程的標準化增加了基于細胞的實驗的定量的一致性。

用Celigo進行細胞計數(shù)應用有如下優(yōu)勢：

1）可進行快速的明亮視野成像和非標記的細胞原位分析；

2）全孔成像的分辨率為1µm/像素；

3）可對多孔微孔板（從1536-孔到6-孔微孔板）和T-flask（T-25和T-75）進行成像；

4）易于使用的界面可對明亮視野中的各種細胞類型進行成像和識別；

5）擁有直接圖像分割（segmentation）和細胞識別軟件；

6）可用圖像和數(shù)據(jù)報告生長曲線、細胞數(shù)目、倍增時間和倍增速度。

圖2 用Celigo對貼壁細胞進行細胞計數(shù)。上圖是用直接細胞計數(shù)應用（the Direct Cell Counting application）拍攝的MDA-MB-436，MCF7和MDA-MB-231細胞系的圖像，下圖是用直接細胞計數(shù)應用對其進行分割后的圖像。

圖3 用Celigo對懸浮細胞進行細胞計數(shù)。上圖是用直接細胞計數(shù)應用（the Direct Cell Counting application）拍攝的CHO，Jurkat和THB-5細胞系的圖像，下圖是用直接細胞計數(shù)應用對其進行分割后的圖像。

 

（二）飽和度計算（Confluency Measurement）

Celigo能對細胞系，包括新建立的、稀有的和不易生長的細胞系，的飽和度和生長特征進行自動的、非標記的、非破壞性的和非侵入性的測定。無需對細胞進行任何操作就可監(jiān)控樣品，使培養(yǎng)物能被原位定量，并可對同一培養(yǎng)物進行隨時間的多次準確讀取。Celigo提供對快速明亮視野成像、圖像分割和分析工具的獨特的整合，使研究者能監(jiān)控細胞培養(yǎng)，生成隨時間的生長曲線，確定倍增速度和倍增時間。

Celigo的飽和度應用能提供如下優(yōu)勢：

1）能對多孔微孔板（從1536-孔到6-孔微孔板）和T-flask（T-25和T-75）進行掃描和分析；

2）能對多孔微孔板進行快速掃描和分析（384-孔微孔板的分析耗時＜8min）；

3）能分析T-25和T-75 flask中的細胞生長（T-75 flask的分析耗時大約15min）；

4）易于使用的界面可獲取和分析圖像；

5）可報告每個孔的飽和度、生長曲線、倍增時間和倍增速度。

圖4 用Celigo進行的非標記明亮視野生長分析。上圖是在96-孔微孔板中培養(yǎng)數(shù)天的貼壁細胞（HeLa）的放大的明亮視野圖像，下圖是對其進行分析的圖像。

圖5 用Celigo計算細胞生長特性。上左圖表示用飽和度應用（Confluence application）報告的單個孔的非標記生長曲線，上右圖表示多孔的縮略圖。下左圖表示倍增速度，下右圖表示倍增時間。

 

（三）非標記的生長跟蹤（Label Free Growth Tracking）/細胞系的特征描述（Cell Line Characterization）

可用Celigo確定原始細胞的生長特性，并在幾分鐘之內(nèi)準確分析細胞系。Celigo可為研究者監(jiān)控細胞生長提供獨特的整合的明亮視野成像、圖像分割和細胞分析工具。特別地，全孔成像和無標記明亮視野細胞計數(shù)使Celigo的用戶能得到隨時間變化的生長曲線，監(jiān)控單個孔水平的細胞數(shù)目、飽和度、倍增速度和倍增時間。

用Celigo進行直接細胞計數(shù)有如下優(yōu)勢：

1）對多孔微孔板進行快速掃描和分析（384-孔微孔板的分析時間＜5min）；

2）易于使用的界面能拍攝和確認明亮視野中的各種不同的細胞；

3）能原位確定細胞的生長特性，直接在它們生長的地方確定；

4）可報告每個孔的生長曲線、細胞數(shù)目、飽和度、倍增時間和倍增速度。

5）可分析T-flask（T-25和T-75）中的細胞生長狀況，分析T-75的耗時大約是15min。

圖6 用Celigo進行無標記的細胞生長分析。使用細胞計數(shù)應用（the Cell Counting application）得到分割的HeLa細胞的放大的明亮視野圖像，上圖是分析得到的細胞數(shù)目，下圖是細胞飽和度。

圖7 用Celigo計量細胞的生長特征。直接細胞計數(shù)應用（the Direct Cell Counting application）報告了單個孔中的非標記生長曲線（上左圖）和多孔微孔板中的生長曲線（上右圖）。它也報告了微孔板的每個孔中的倍增時間（下左圖）和倍增速度（下右圖）。

 

（四）細胞增殖實驗（Proliferation Assay）

評估培養(yǎng)細胞生長的增殖活性是監(jiān)控細胞的健康和生長速度的基礎工具。很多研究者利用基于代謝的定量方法，如MTT或MTS方法來評估和確認化合物對細胞增殖的影響。然而，這些終點法要求研究者將代謝活性的計量作為細胞數(shù)目的間接顯示，并且實驗是破壞性的，每個時間點都需要使用新的樣品。Celigo可利用它的細胞計數(shù)應用，進行自動化的、非標記的、非破壞性的和非侵入性的增殖實驗。

Celigo的細胞計數(shù)方法有如下優(yōu)勢：

1）可原位對細胞進行直接成像和計數(shù)；

2）非標記的細胞計數(shù)無需試劑；

3）可對每個孔的每個細胞進行準確的、全孔的明亮視野成像和分割計數(shù)；

4）可對相同樣品進行多重讀取，降低成本和勞動力；

5）可利用每孔中細胞的確切數(shù)目，進行準確的標準化；

6）可進行細胞形態(tài)檢驗和分析。

 

圖8 Celigo和MTT實驗方法的對比。Celligo在多個時間點分析細胞，并用實時明亮視野成像方法對細胞進行直接原位計數(shù)，來準確計量細胞的增殖情況。MTT法在一個時間點分析細胞，并間接評估細胞的增殖情況。

圖9 用Celigo生成的濃度響應曲線。左圖和中圖表示用Celigo進行的Colo-205細胞對化合物X和5-FU的不同響應的圖像分析（細胞計數(shù)）。右圖表示用MTT法分析Colo-205細胞在某個時間點的響應。

 

（五）評估細胞健康狀況（Cell Health Analysis）

Celigo可用于快速評估細胞的健康狀況，該項易于操作的應用可對不同類型的細胞進行簡單而快速的細胞活力分析和細胞凋亡分析。細胞活力的應用分別用calcein AM，propidium iodide和Hoechst對活細胞、死細胞和所有細胞進行確認和計數(shù)。相似地，磷脂酰絲氨酸外部化（Phosphatidylserine Externalization）應用通過分別用annexin V，propidium iodide和Hoechst定量報告凋亡細胞、死細胞和所有細胞的個數(shù)，來計算細胞凋亡。

用Celigo分析細胞健康狀況有如下優(yōu)勢：

1）易于使用的界面來確認細胞健康狀況；

2）快速掃描和分析（用3個熒光通道掃描和分析96-孔微孔板耗時＜12min）；

3）可兼容多種微孔板類型（從1536-孔到6-孔微孔板）；

4）先進的類似流式細胞技術的分類（flow cytometry-like gating）。

圖10 用Celigo觀察細胞活力。左圖是用三種染料得到的典型圖像，右圖是用過氧化氫處理Hela細胞時的濃度響應曲線。

 

圖11 Celigo的磷脂酰絲氨酸外部化（Phosphatidylserine externalization）應用。左圖是用3種染料得到的典型圖像，右圖是用喜樹堿（camptothecin）處理的凋亡的Jurkat細胞。

 

（六）腫瘤球體分析（Tumor Sphere Analysis）

用Celigo可對懸浮培養(yǎng)的腫瘤球體，如mammospheres和neurospheres進行快速、準確地分析。這種自動化的形態(tài)學分析可以顯著減少用于定量3D球體關鍵特性的時間和精力，這種關鍵特性包括球體的大小、生長、隨時間的生長跟蹤和對化學治療劑的反應。對不同癌癥細胞系和主要癌癥細胞產(chǎn)生的腫瘤球體的分析可用來評估球體形成效率、致腫瘤性和癌癥細胞的自我更新能力。

用Celigo進行腫瘤球體分析有如下優(yōu)勢：

1）可對與惡性腫瘤行為相關的活球體進行非破壞性定量測定；

2）可對懸浮的球體進行全孔成像（從96-孔到6-孔微孔板）；

3）可進行快速數(shù)據(jù)分析（掃描和分析整個12-孔微孔板耗時＜15min）；

4）可分析球體數(shù)目、大小、形狀和隨時間的生長動力學數(shù)據(jù)。

 

圖12 用Celigo進行腫瘤球體分析。從MCF10DCIS.COM細胞（MCF10A細胞系的癌變前克?。┑玫降姆指詈蟮脑糾ammosphere的實時圖像。

圖13 用Celigo分析藥物處理過的腫瘤球體。上圖是人膠質(zhì)母細胞瘤，下圖是人乳腺癌細胞。

 

（七）細胞分泌分析（Cell Secretion Analysis）

Celigo可用于快速和準確地監(jiān)控生物醫(yī)藥細胞系隨時間的分泌速率，這在維持細胞系的生產(chǎn)水平方面是十分關鍵的。Celigo在細胞分泌方面的應用可測量單個細胞的蛋白分泌量，如生產(chǎn)抗體的雜交瘤細胞。這種單個細胞水平的數(shù)據(jù)不僅可以提供有價值的對整體生產(chǎn)水平的深入了解，還可以提供對細胞系的均一性的深入了解，而均一性是開發(fā)新細胞系的重要選擇標準。此應用利用Cyntellect的專利性的分泌分析法來檢測和定量熒光標記的目標細胞周圍的“分泌環(huán)（Secretion Halo）”。

用Celigo檢測細胞分泌有如下優(yōu)勢：

1）有易于使用的界面，來確定分泌細胞和報告統(tǒng)計數(shù)據(jù)；

2）可報告每個孔中的分泌細胞的數(shù)量和百分比；

3）可報告細胞分泌信號的平均強度和累積強度；

4）可分析細胞群的均一性；

5）可平行處理大量的樣品。

 

圖14 左圖是細胞分泌實驗的示例。右圖顯示的是進行細胞分泌實驗的形成分泌圈的CHO-S細胞的典型圖像。綠色和黃色的熒光表示CHO-S細胞，而外圍的紅色熒光表示分泌出的蛋白質(zhì)（IgG）。

圖15 左圖表示用Celigo進行的細胞分泌分析。右圖表示對應的圖像分割，綠色分割表示THB-5細胞，黃色分割表示分泌圈。

 

（八）克隆確認和擴張（Clonal Validation & Expansion）

克隆形成的確認是生物醫(yī)藥細胞系繁殖的關鍵步驟。具有卓越的明亮視野成像質(zhì)量，Celigo可以可靠的捕捉到單個孔中的單個細胞，即使此細胞黏附在孔壁上，并確認從此單個細胞可發(fā)展成一個克隆。典型的，在多孔板上進行有限稀釋，然后在一段時間內(nèi)用Celigo進行重復拍照。這樣，培養(yǎng)幾天后，就可觀察到克隆的生長，就可能回溯得到克隆由單個細胞生長而得的結論。

用Celigo進行克隆確認有如下優(yōu)勢：

1）能對多孔微孔板進行快速的明亮視野掃描（384-孔微孔板的掃描耗時＜5min）；

2）準確的圖像分割，可檢測到單個孔中的單個細胞；

3）可對每孔中的細胞數(shù)目進行heatmap表達；

4）可生成監(jiān)控細胞生長的生長跟蹤報告；

5）能對圖像和數(shù)據(jù)進行高效的數(shù)據(jù)庫管理。

 

圖16 用Celigo觀察克隆擴張。顯示的是單個的CHO-S細胞擴展形成克隆的明亮視野圖像。

 

圖17 用Celigo自動檢測單個的CHO-S細胞。左圖是單個細胞分割的典型的明亮視野圖像，右圖是顯示每個孔中的細胞數(shù)目的heatmap。

 

（九）細胞周期分析（Cell Cycle Analysis）

細胞周期分析常用來篩選影響細胞生長和增殖的化合物。Celigo允許用戶使用專門為流式細胞技術開發(fā)的實驗方法進行貼壁細胞的細胞周期分析。Celigo軟件的靈活的分類界面被用來確認和定量處于不同細胞周期的細胞的數(shù)目。這種分析可使用單一的染料，如DAPI染料，或使用顯示DNA合成的第二個標記物，如BrdU染料。此外，還有使用能標記有絲分裂，如組蛋白H3磷酸化的標記物對其進行多元分析的潛能。

用Celigo進行表達分析應用有如下優(yōu)勢：

1）能類似流式細胞技術（flow cytometry）對DNA的含量進行柱狀圖表達（histogram representation）；

2）能用散點圖（scatter plot representation）表達DNA含量vs.DNA合成的色塊，以確認細胞周期的每個階段；

3）易于使用的界面能條理化從圖像獲取到生成多孔板水平數(shù)據(jù)的應用；

4）能靈活地命名通道，確定分割的特征，進行細胞的分類，從而定制研究者的應用。

圖18 用Celigo進行細胞周期分析。用Celigo的表達分析應用（the Expression Analysis application）確定A549細胞的細胞周期。上左圖是類似流式細胞技術的DNA含量的柱狀圖。上右圖通過表示DNA合成色塊vs.DNA含量色塊的累積強度，得到典型的對細胞周期的“馬蹄形”（“Horse Shoe”）可視化圖像。下左圖顯示BrdU染料和DAPI染料的2色圖像。下右圖顯示微孔板水平數(shù)據(jù)結果的heatmap，如處于S-期的細胞的百分比。

 

（十）多參數(shù)分類（Multiparameter Gating）

Celigo軟件提供對明亮視野圖像和熒光圖像進行多通道分析的快速的解決方案，并可對細胞進行基于強度和形態(tài)參數(shù)的識別。此外，一個強大的但又易于使用的分類界面可對細胞群進行類似流式細胞技術（flow cytometry）的分析。特別的，一旦熒光或明亮視野圖像被分割成多個對象，Celigo就使用基于形態(tài)或強度的一系列分類（gate）來定義細胞群和細胞分類，報告統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

Celigo軟件的這種多參數(shù)分類功能有如下優(yōu)勢：

1）可定義無限多個圖表和細胞群；

2）使用柱狀圖和散點圖對細胞群進行交互的，實時的分類；

3）對柱狀圖進行多范圍和多splitter gates的分類；

4）對散點圖進行四象限分類和多邊形分類；

5）運用全套的布爾算子（Boolean operators）綜合不同的分類；

6）可報告所有孔的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，確認細胞分類。

圖19 Celigo的分類界面。在對明亮視野圖像和熒光圖像進行分析之后，Celigo軟件可用柱狀圖（上左圖）和散點圖（下圖）表達分割數(shù)據(jù)?？纱_認無限多個圖表（plots），分類（gates）和細胞群，細胞可以用顏色覆蓋（color overlay）方法進行分類（上右圖）。

 

（十一）標記物分析（Marker Analysis）

用Celigo可以準確定量分析轉錄因子、細胞信號和細胞表面標記物表達。Celigo為研究者提供了獨特的對明亮視野和熒光成像、圖像分割、分析工具的綜合功能，來快速評估常見的免疫細胞化學染色和進行高通量篩選。實驗可進行多元檢測，并同時定量多種標記物。雖然微孔中的二次抽樣（subsampling）可用于準確分析單個的細胞，全孔的影像也是必須的，以準確分析克隆，如干細胞克隆，的標記物表達。

用Celigo進行標記物分析有如下優(yōu)勢：

1）可對多孔的微孔板進行全孔成像和分析（掃描和分析整個96-孔微孔板耗時＜16min）；

2）易于使用的界面可對大量的細胞類型上的標記物進行成像和分析；

3）先進的類流式分類（flow-like gating）界面可支持亞群（subpopulation）的分析；

4）可分析細胞和克隆的標記物表達；

5）可對分析和定量結果進行微孔板水平的概述。

圖20 用Celigo進行標記物分析。上圖是用SSEA4染色的matrigel上的hiPSCs圖像，下圖是用表達分析應用（the Expression Analysis application）進行分割后的圖像。細胞核被分割成mask，SSEA4陽性的細胞核被分割成目標物，來決定表達SSEA4的細胞的百分比。

圖21 用Celigo分析細胞核標記物的表達。上圖和左下圖是用KLF4染色的reprogrammed成纖維細胞的圖像，右下圖是用表達分析應用（the Expression Analysis application）進行分割后的圖像。

 

（十二）轉染和轉導的優(yōu)化（Transfection & Transduction Optimization）

Celigo可優(yōu)化細胞轉染和轉導，包括如何選擇實驗條件、決定合時的質(zhì)粒/病毒量，評估轉染/轉導后表達目標結構的的最佳時間。運用Celigo的熒光報告子和非破壞性原位成像技術，這些參數(shù)可通過在一段時間內(nèi)重復拍攝一組微孔或flask進行快速優(yōu)化。準確的全孔明亮視野細胞計數(shù)可生成用絕對細胞數(shù)目標準化的基于細胞的數(shù)據(jù)。

Celigo的基于細胞的熒光定量性能（cell-based fluorescence quantification）有如下優(yōu)勢：

1）可對轉染/轉導培養(yǎng)基進行快速的、全孔的分析（從1536-孔到6-孔微孔板）；

2）可快速確認高效率轉染/轉導的最優(yōu)參數(shù)；

3）利用實時成像確定短時的和穩(wěn)定的轉染/轉導；

4）通過對同一個微孔或flask進行重復成像，可以生成時間進程數(shù)據(jù)；

5）可評估抗生素誘導的表達和抗生素的選擇方法；

6）可對很多不同的貼壁細胞和非貼壁細胞類型進行可靠分析。

圖22 用Celigo獲得的轉導后的成纖維細胞。左圖是12-孔微孔板中的實時全孔圖像，右圖是放大的用GFP慢病毒轉導的人包皮成纖維細胞圖像。

圖23 用Celigo對轉導后的成纖維細胞進行分割。用表達分析應用（the Expression Analysis application）對分割進行實時成像。細胞核被分割成mask（左圖），而GFP-陽性的細胞核被分割成目標（右圖）來決定轉導效率。

 

圖24 用Celigo進行轉導優(yōu)化。用Celigo獲取和分析人包皮成纖維細胞用不同劑量的GFP慢病毒轉導后的圖像和圖像分析。

 

（十三）干細胞特征描述（Stem Cell Characterization）

用Celigo可以快速掃描和評估在任何標準微孔板里生長的干細胞，極大地減少了描述這些復雜的培養(yǎng)物的時間和精力?？煽焖佾@得全孔的明亮視野和/或熒光圖像，以分析干細胞培養(yǎng)的健康狀況，分化狀態(tài)和splitting倍數(shù)/比率。Celigo也可用于評估與干細胞聯(lián)合的蛋白質(zhì)的表達?？赏ㄟ^在一段時間內(nèi)重復拍攝相同的微孔板觀察培養(yǎng)物隨時間的變化，來監(jiān)控reprogramming和分化（differentiation）的進程。

用Celigo進行干細胞培養(yǎng)分析具有如下優(yōu)勢：

1）可對干細胞培養(yǎng)物進行快速的、全孔的成像（從96-孔到6-孔微孔板，掃描整個6-孔微孔板的時間大約是10min）；

2）可獲得明亮視野和多達3個熒光通道的圖像；

3）可跟蹤活的干細胞培養(yǎng)物來分析分化狀態(tài)；

4）可分析活的和固定的干細胞的染色類型；

5）可消除用傳統(tǒng)的顯微鏡收集和分析圖像的繁重的勞動。

 

圖25 用Celigo進行干細胞的特征描述。左圖是6-孔微孔板的全孔圖像，中圖和右圖是用特征性的干細胞標記物染色的hiPSCs細胞的放大圖像。

 

圖26 用Celigo記錄隨時間進行的reprogramming。顯示reprogrammed人成纖維細胞的實時全孔圖像（12-孔微孔板）。

 

（十四）感染性實驗（Infectivity Assay）

用Celigo可以快速評估細胞病變效應（Cytopathic Effect，CPE），即因為疾病感染引起的細胞的退行性改變，包括細胞變圓，膨脹/收縮和顆粒狀。使用明亮視野、全孔成像、自動化分割和分析，Celigo提供基于宿主細胞單層特征變化的細胞病變效應（CPE）的定量描述?？衫枚嗫孜⒖装宥勘徊煌味炔《靖腥镜闹貜蜆悠?，以獲得可靠的結果。

Celigo提供如下優(yōu)勢：

1）個體分割和分析對感染的程度（magnitude of infection，MOI）提供定量的分析；

2）自動化的樣品分析可減少時間、勞力和變異性；

3）高通量和可放大：分析96-孔或384-孔微孔板的耗時＜10min；

4）可拍攝高分辨率的全孔圖像，以便進行文件化（documentation），跟蹤（audit trail）或手動評估細胞病變效應（CPE）；

5）支持基于熒光的與感染性相關的多功能實驗（如表達分析，凋亡）。

 

圖27 用Celigo觀察的感染性實驗。表示不同感染程度的哺乳細胞的實時圖像。用細胞計數(shù)法和飽和度法分析感染程度（MOI）。

 

圖28 用Celigo得到的典型heatmap。顯示BVD感染實驗的結果，無感染孔為綠色，感染孔為紅色。

 

（十五）基于細胞形態(tài)的篩選（Morphology Based Screening）

使用Celigo可以準確定量藥物篩選中廣泛使用的對化合物的細胞毒性的評估。細胞形態(tài)的改變是細胞健康性的標志，可用來確定潛在的候選藥物。Celigo可在原位對貼壁細胞進行快速和無標記的成像，并定量形態(tài)參數(shù)。明亮視野成像分割算法可基于細胞的形態(tài)確認細胞，并將它們按照相似的形態(tài)進行分類。因為這些形態(tài)學工具無需使用任何標記，所以細胞可在長時間內(nèi)進行重新成像和分析，并進行大量的形態(tài)學實驗來確認潛在的藥物作用。

Celigo的明亮視野成像具有如下優(yōu)勢：

1）可進行快速和無標記的明亮視野獲取和分析；

2）可開發(fā)基于形態(tài)計量的細胞實驗；

3）可基于細胞形態(tài)，對細胞進行識別和分類；

4）易于使用的界面可獲取和分析圖像。

 

圖29 用Celigo進行基于細胞形態(tài)的篩選。DU145前列腺癌細胞的明亮視野圖像被分割成圓形、扁形或所有細胞。對照孔中的細胞（上圖）大多數(shù)是扁形的，圓形細胞的百分比很少。藥物處理孔中用Celastrol處理的細胞（下圖）變得更圓，并有高百分比的圓形細胞。

 

（十六）高通量篩選（High-Throughput Screening）

利用大視野光學元件和專利的高速成像系統(tǒng)，Celigo無需移動微孔板就可以進行多視野成像。幾乎所有的微孔板型號（從6-孔到1536-孔微孔板）都可以在明亮視野（brightfield）和3通道熒光通道中進行全孔成像或部分成像。獨特的明亮視野光學元件能對處在孔邊緣的細胞進行準確的分割。定量的基于細胞和/或基于微孔的數(shù)據(jù)可在數(shù)據(jù)庫中進行管理、實驗分析和解析。

用Celigo進行高通量成像具有如下優(yōu)勢：

1）很快速的掃描（掃描384-孔微孔板耗時＜5min）；

2）軟件可直接對圖像進行分割；

3）和機械臂裝載系統(tǒng)完全兼容；

4）先進的類流式分類（flow-like gating）界面可支持亞群（subpopulation）分析；

5）準確的、全孔的明亮視野細胞計數(shù)可用于對實驗結果進行標準化。

 

圖30 用Celigo對1536-孔微孔板進行基于細胞的篩選。HeLa細胞表達tuboGFP或FP602。

 

圖31 結果輸出選項包括能快速顯示趨勢和異常值的heatmap。

 

（十七）方法學發(fā)展（Assay Development）

Celigo的靈活性和易于使用性方便了基于細胞的實驗的優(yōu)化和隨后的對實驗性能的評估?？赏ㄟ^先在一種微孔板上實驗，再完美地轉移到更高密度的微孔板，如384-孔或1536-孔微孔板上進行方法的開發(fā)，并使用同樣的儀器進行驗證。Celigo的3色熒光通道和明亮視野，可用來在全孔中準確標準化細胞的數(shù)目，豐富的類流式細胞儀的分類界面可進行大量的基于細胞的實驗，并且在解決實驗問題方面是極為有用的。

Celigo的方法學發(fā)展有如下優(yōu)勢：

1）簡單易懂的細胞分割軟件；

2）結合布爾算子的類流式細胞儀的分類（flow cytometry-like gating）界面可進行細胞分類；

3）特殊的算法可分析多細胞結構；

4）支持多用戶使用；

5）支持多孔微孔板（從1536-孔到6-孔微孔板）和T-flask（T-25和T-75）；

6）數(shù)據(jù)庫可高效管理實驗數(shù)據(jù)。

圖32 Celigo的成像多樣性。成像實驗可在不同微孔板類型中完美轉移，如6-孔，96-孔和1536-孔微孔板。

圖33 Celigo分類界面可分析細胞的亞群。散點圖（左圖）可用來將桔黃色細胞從綠色細胞（右圖）中分離開來，以便進一步分析。

 

Celigo細胞分析儀應用總結；

（一）細胞培養(yǎng)管理（Cell Culture Management）：細胞計數(shù)；飽和度計算；

（二）細胞計數(shù)（Cell Cytometry）：細胞計數(shù)；標記物分析；基于細胞形態(tài)的篩選；多參數(shù)分類；

（三）基于細胞的篩選（Cell-Based Screening）：方法學發(fā)展；細胞系的特征描述；高通量篩選；標記物分析；細胞增殖實驗；轉染和轉導的優(yōu)化；

（四）生物藥學細胞系的開發(fā)（Biopharmaceutical Cell Line Development）：細胞健康狀況評估；細胞分泌分析；克隆確認和擴張；

（五）癌癥研究（Cancer Research)：細胞周期分析；非標記的生長跟蹤；基于細胞形態(tài)的篩選；多參數(shù)分類；細胞增殖實驗；腫瘤球體分析；

（六）干細胞研究（Stem Cell Research）：干細胞特征描述

（七）細胞毒性研究（Toxicology）：細胞健康狀況評估；感染性實驗；基于細胞形態(tài)的篩選。

 

Celigo細胞儀的參數(shù)設置

（一）實驗器具類型

1）1536-、384-、96-、24-和6-孔微孔板；

2）T-25和T-75 flasks。

（二）掃描時間

1）掃描整個微孔板僅耗時5-15min。

（三）分辨率

1）1µm/像素；0.25 NA全分辨率（可選擇2 x 2 binning mode）。

（四）檢測器

1）CCD（2052 x 2052像素）；

（五）檢測模式

1）基于LED的改進的明亮視野成像，對整個孔有均勻一致的照明度；

2）基于LED的熒光成像，帶3個激發(fā)和發(fā)射濾光片組。

（六）熒光檢測范圍

1）除了明亮視野，還有3個激發(fā)和發(fā)射濾光片，共提供4個成像通道；

2）熒光波長包括：

（七）對焦功能

1）有基于圖像的自動對焦功能和快速的獨立于圖像的自動對焦功能。

（八）計算機硬件

1）Dell Precision T3500或相似的配置；

2）可用USB 3.0外部驅(qū)動進行額外的數(shù)據(jù)存儲。

（九）軟件輸出

1）圖像輸出文件格式：TIFF，JPEG，BMP；

2）數(shù)據(jù)庫存儲的圖像格式：JPEG2000。

（十）尺寸

1）尺寸：19” X 25” X 20” (48 cm x 64 cm x 51 cm)；

2）重量：117磅（53kg）。

（十一）電源

1）110-220 VAC 50-60 Hz（需要3相電源插座）。