Celigo細(xì)胞分析儀可分析生長(zhǎng)在微孔板和T-flask中的貼壁和非貼壁（懸?。┘?xì)胞，具有超越傳統(tǒng)方法的更好的優(yōu)勢(shì)。Celigo具有特別一致的，高質(zhì)量，全孔的明亮視野（brightfield）成像功能，結(jié)合強(qiáng)大的分割軟件可在5分鐘內(nèi)獲得整個(gè)微孔板的所有孔中的所有細(xì)胞的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。Celigo具有非破壞性和非侵入性明亮視野分析功能，并有多色熒光功能作補(bǔ)充，使系統(tǒng)適合任何實(shí)驗(yàn)室中的基于細(xì)胞的廣泛的實(shí)驗(yàn)。
圖1 Celigo細(xì)胞分析儀
Celigo細(xì)胞分析儀具有下列特征和優(yōu)勢(shì)：
1）可接受T-flask（T-25和T-75）和多數(shù)微孔板（1536孔板到6孔板）；
2）可在整個(gè)孔的范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確的明亮視野細(xì)胞成像和識(shí)別；
3）具有三通道熒光（除了明亮視野功能）：紅色熒光、綠色熒光和藍(lán)色熒光；
4）極快速的掃描（掃描整塊微孔板大約耗時(shí)5-15min）；
5）有直觀并易于使用的，功能強(qiáng)大的，軟件分割和分類界面；
6）可選擇的API軟件，可進(jìn)行機(jī)械臂裝載整合。
Celigo細(xì)胞分析儀的杰出的性能主要取決于它的獨(dú)特的光學(xué)通路，此光學(xué)通路應(yīng)用了一個(gè)大型的F-theta透鏡和檢流計(jì)鏡片來進(jìn)行大面積快速掃描。與傳統(tǒng)的基于顯微鏡的儀器不同，此系統(tǒng)可掃描整個(gè)孔，而無需移動(dòng)微孔板，并保持一致的亮度對(duì)孔邊緣的細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞識(shí)別。
Celigo可檢測(cè)的細(xì)胞分析參數(shù)：
1）總細(xì)胞數(shù)目（Total Cell Number）；2）分類細(xì)胞數(shù)目（Gated Cell Number）；3）分類細(xì)胞百分比（Percentage of Gated Cells）；4）細(xì)胞密度（Cell Density）；5）細(xì)胞面積（Cell Area）；6）細(xì)胞平均強(qiáng)度（Cell Mean Intensity）；7）細(xì)胞累積強(qiáng)度（Cell Integrated Intensity）；8）細(xì)胞長(zhǎng)寬比（Cell Aspect Ratio）；9）細(xì)胞形狀因子（Cell Form Factor）；10）細(xì)胞光滑度（Cell Smoothness）；11）克隆直徑（Colony Diameter）；12）克隆周長(zhǎng)（Colony Perimeter）。
Celigo細(xì)胞分析儀的應(yīng)用
（一）明亮視野無標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞生長(zhǎng)跟蹤（Cell Counting & Growth Tracking）
用于進(jìn)行細(xì)胞系特征描述，克隆確認(rèn)，和基于形態(tài)學(xué)的篩選。
2）克隆計(jì)數(shù)：球體分析（Colony Counting: Sphere Analysis）
用于進(jìn)行EB特征描述和腫瘤球體分析。
3）飽和度（Confluency）
用于細(xì)胞系特征描述和侵染性實(shí)驗(yàn)。
（二）熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞生長(zhǎng)跟蹤（Cell Counting & Growth Tracking）
用于進(jìn)行細(xì)胞系特征描述，克隆確認(rèn)，和基于形態(tài)學(xué)的篩選。
2）細(xì)胞分泌實(shí)驗(yàn)（Cell Secretion Assay）
用于細(xì)胞分泌分析。
3）細(xì)胞活力（Cell Viability）
用于方法學(xué)發(fā)展，細(xì)胞健康性實(shí)驗(yàn)和高通量篩選。
4）DNA合成（DNA Synthesis）
用于細(xì)胞周期分析，細(xì)胞健康性實(shí)驗(yàn)，高通量篩選和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。
5）表達(dá)分析（Expression Analysis）
用于細(xì)胞信號(hào)，高通量篩選，標(biāo)記分析和轉(zhuǎn)染優(yōu)化。
6）磷脂酰絲氨酸外部化（Phosphatidylserine Externalization）
用于方法學(xué)發(fā)展，細(xì)胞健康性實(shí)驗(yàn)和高通量篩選。
應(yīng)用詳述：
（一）細(xì)胞計(jì)數(shù)（Cell Counting）
Celigo的細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)用，描述了全孔非標(biāo)記明亮視野成像的特征，極大地提高了細(xì)胞培養(yǎng)物中計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，并且消除了過去需要分離酶和血細(xì)胞計(jì)數(shù)器才能確定細(xì)胞培養(yǎng)密度的狀況。Celigo細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)用的靈活性和易于使用性也可以監(jiān)控隨時(shí)間的細(xì)胞生長(zhǎng)，并方便對(duì)培養(yǎng)的日常管理。這個(gè)過程的標(biāo)準(zhǔn)化增加了基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)的定量的一致性。
用Celigo進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)用有如下優(yōu)勢(shì)：
1）可進(jìn)行快速的明亮視野成像和非標(biāo)記的細(xì)胞原位分析；
2）全孔成像的分辨率為1µm/像素；
3）可對(duì)多孔微孔板（從1536-孔到6-孔微孔板）和T-flask（T-25和T-75）進(jìn)行成像；
4）易于使用的界面可對(duì)明亮視野中的各種細(xì)胞類型進(jìn)行成像和識(shí)別；
5）擁有直接圖像分割（segmentation）和細(xì)胞識(shí)別軟件；
6）可用圖像和數(shù)據(jù)報(bào)告生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞數(shù)目、倍增時(shí)間和倍增速度。
圖2 用Celigo對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。上圖是用直接細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)用（the Direct Cell Counting application）拍攝的MDA-MB-436，MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞系的圖像，下圖是用直接細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)用對(duì)其進(jìn)行分割后的圖像。
圖3 用Celigo對(duì)懸浮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。上圖是用直接細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)用（the Direct Cell Counting application）拍攝的CHO，Jurkat和THB-5細(xì)胞系的圖像，下圖是用直接細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)用對(duì)其進(jìn)行分割后的圖像。
（二）飽和度計(jì)算（Confluency Measurement）
Celigo能對(duì)細(xì)胞系，包括新建立的、稀有的和不易生長(zhǎng)的細(xì)胞系，的飽和度和生長(zhǎng)特征進(jìn)行自動(dòng)的、非標(biāo)記的、非破壞性的和非侵入性的測(cè)定。無需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行任何操作就可監(jiān)控樣品，使培養(yǎng)物能被原位定量，并可對(duì)同一培養(yǎng)物進(jìn)行隨時(shí)間的多次準(zhǔn)確讀取。Celigo提供對(duì)快速明亮視野成像、圖像分割和分析工具的獨(dú)特的整合，使研究者能監(jiān)控細(xì)胞培養(yǎng)，生成隨時(shí)間的生長(zhǎng)曲線，確定倍增速度和倍增時(shí)間。
Celigo的飽和度應(yīng)用能提供如下優(yōu)勢(shì)：
1）能對(duì)多孔微孔板（從1536-孔到6-孔微孔板）和T-flask（T-25和T-75）進(jìn)行掃描和分析；
2）能對(duì)多孔微孔板進(jìn)行快速掃描和分析（384-孔微孔板的分析耗時(shí)＜8min）；
3）能分析T-25和T-75 flask中的細(xì)胞生長(zhǎng)（T-75 flask的分析耗時(shí)大約15min）；
4）易于使用的界面可獲取和分析圖像；
5）可報(bào)告每個(gè)孔的飽和度、生長(zhǎng)曲線、倍增時(shí)間和倍增速度。
圖4 用Celigo進(jìn)行的非標(biāo)記明亮視野生長(zhǎng)分析。上圖是在96-孔微孔板中培養(yǎng)數(shù)天的貼壁細(xì)胞（HeLa）的放大的明亮視野圖像，下圖是對(duì)其進(jìn)行分析的圖像。
圖5 用Celigo計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)特性。上左圖表示用飽和度應(yīng)用（Confluence application）報(bào)告的單個(gè)孔的非標(biāo)記生長(zhǎng)曲線，上右圖表示多孔的縮略圖。下左圖表示倍增速度，下右圖表示倍增時(shí)間。
（三）非標(biāo)記的生長(zhǎng)跟蹤（Label Free Growth Tracking）/細(xì)胞系的特征描述（Cell Line Characterization）
可用Celigo確定原始細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，并在幾分鐘之內(nèi)準(zhǔn)確分析細(xì)胞系。Celigo可為研究者監(jiān)控細(xì)胞生長(zhǎng)提供獨(dú)特的整合的明亮視野成像、圖像分割和細(xì)胞分析工具。特別地，全孔成像和無標(biāo)記明亮視野細(xì)胞計(jì)數(shù)使Celigo的用戶能得到隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線，監(jiān)控單個(gè)孔水平的細(xì)胞數(shù)目、飽和度、倍增速度和倍增時(shí)間。
用Celigo進(jìn)行直接細(xì)胞計(jì)數(shù)有如下優(yōu)勢(shì)：
1）對(duì)多孔微孔板進(jìn)行快速掃描和分析（384-孔微孔板的分析時(shí)間＜5min）；
2）易于使用的界面能拍攝和確認(rèn)明亮視野中的各種不同的細(xì)胞；
3）能原位確定細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，直接在它們生長(zhǎng)的地方確定；
4）可報(bào)告每個(gè)孔的生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞數(shù)目、飽和度、倍增時(shí)間和倍增速度。
5）可分析T-flask（T-25和T-75）中的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，分析T-75的耗時(shí)大約是15min。
圖6 用Celigo進(jìn)行無標(biāo)記的細(xì)胞生長(zhǎng)分析。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)用（the Cell Counting application）得到分割的HeLa細(xì)胞的放大的明亮視野圖像，上圖是分析得到的細(xì)胞數(shù)目，下圖是細(xì)胞飽和度。
圖7 用Celigo計(jì)量細(xì)胞的生長(zhǎng)特征。直接細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)用（the Direct Cell Counting application）報(bào)告了單個(gè)孔中的非標(biāo)記生長(zhǎng)曲線（上左圖）和多孔微孔板中的生長(zhǎng)曲線（上右圖）。它也報(bào)告了微孔板的每個(gè)孔中的倍增時(shí)間（下左圖）和倍增速度（下右圖）。
（四）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（Proliferation Assay）
評(píng)估培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的增殖活性是監(jiān)控細(xì)胞的健康和生長(zhǎng)速度的基礎(chǔ)工具。很多研究者利用基于代謝的定量方法，如MTT或MTS方法來評(píng)估和確認(rèn)化合物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。然而，這些終點(diǎn)法要求研究者將代謝活性的計(jì)量作為細(xì)胞數(shù)目的間接顯示，并且實(shí)驗(yàn)是破壞性的，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都需要使用新的樣品。Celigo可利用它的細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)用，進(jìn)行自動(dòng)化的、非標(biāo)記的、非破壞性的和非侵入性的增殖實(shí)驗(yàn)。
Celigo的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法有如下優(yōu)勢(shì)：
1）可原位對(duì)細(xì)胞進(jìn)行直接成像和計(jì)數(shù)；
2）非標(biāo)記的細(xì)胞計(jì)數(shù)無需試劑；
3）可對(duì)每個(gè)孔的每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的、全孔的明亮視野成像和分割計(jì)數(shù)；
4）可對(duì)相同樣品進(jìn)行多重讀取，降低成本和勞動(dòng)力；
5）可利用每孔中細(xì)胞的確切數(shù)目，進(jìn)行準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)化；
6）可進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)檢驗(yàn)和分析。
圖8 Celigo和MTT實(shí)驗(yàn)方法的對(duì)比。Celligo在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)分析細(xì)胞，并用實(shí)時(shí)明亮視野成像方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行直接原位計(jì)數(shù)，來準(zhǔn)確計(jì)量細(xì)胞的增殖情況。MTT法在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)分析細(xì)胞，并間接評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。
圖9 用Celigo生成的濃度響應(yīng)曲線。左圖和中圖表示用Celigo進(jìn)行的Colo-205細(xì)胞對(duì)化合物X和5-FU的不同響應(yīng)的圖像分析（細(xì)胞計(jì)數(shù)）。右圖表示用MTT法分析Colo-205細(xì)胞在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的響應(yīng)。
（五）評(píng)估細(xì)胞健康狀況（Cell Health Analysis）
Celigo可用于快速評(píng)估細(xì)胞的健康狀況，該項(xiàng)易于操作的應(yīng)用可對(duì)不同類型的細(xì)胞進(jìn)行簡(jiǎn)單而快速的細(xì)胞活力分析和細(xì)胞凋亡分析。細(xì)胞活力的應(yīng)用分別用calcein AM，propidium iodide和Hoechst對(duì)活細(xì)胞、死細(xì)胞和所有細(xì)胞進(jìn)行確認(rèn)和計(jì)數(shù)。相似地，磷脂酰絲氨酸外部化（Phosphatidylserine Externalization）應(yīng)用通過分別用annexin V，propidium iodide和Hoechst定量報(bào)告凋亡細(xì)胞、死細(xì)胞和所有細(xì)胞的個(gè)數(shù)，來計(jì)算細(xì)胞凋亡。
用Celigo分析細(xì)胞健康狀況有如下優(yōu)勢(shì)：
1）易于使用的界面來確認(rèn)細(xì)胞健康狀況；
2）快速掃描和分析（用3個(gè)熒光通道掃描和分析96-孔微孔板耗時(shí)＜12min）；
3）可兼容多種微孔板類型（從1536-孔到6-孔微孔板）；
4）先進(jìn)的類似流式細(xì)胞技術(shù)的分類（flow cytometry-like gating）。
圖10 用Celigo觀察細(xì)胞活力。左圖是用三種染料得到的典型圖像，右圖是用過氧化氫處理Hela細(xì)胞時(shí)的濃度響應(yīng)曲線。
圖11 Celigo的磷脂酰絲氨酸外部化（Phosphatidylserine externalization）應(yīng)用。左圖是用3種染料得到的典型圖像，右圖是用喜樹堿（camptothecin）處理的凋亡的Jurkat細(xì)胞。
（六）腫瘤球體分析（Tumor Sphere Analysis）
用Celigo可對(duì)懸浮培養(yǎng)的腫瘤球體，如mammospheres和neurospheres進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地分析。這種自動(dòng)化的形態(tài)學(xué)分析可以顯著減少用于定量3D球體關(guān)鍵特性的時(shí)間和精力，這種關(guān)鍵特性包括球體的大小、生長(zhǎng)、隨時(shí)間的生長(zhǎng)跟蹤和對(duì)化學(xué)治療劑的反應(yīng)。對(duì)不同癌癥細(xì)胞系和主要癌癥細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤球體的分析可用來評(píng)估球體形成效率、致腫瘤性和癌癥細(xì)胞的自我更新能力。
用Celigo進(jìn)行腫瘤球體分析有如下優(yōu)勢(shì)：
1）可對(duì)與惡性腫瘤行為相關(guān)的活球體進(jìn)行非破壞性定量測(cè)定；
2）可對(duì)懸浮的球體進(jìn)行全孔成像（從96-孔到6-孔微孔板）；
3）可進(jìn)行快速數(shù)據(jù)分析（掃描和分析整個(gè)12-孔微孔板耗時(shí)＜15min）；
4）可分析球體數(shù)目、大小、形狀和隨時(shí)間的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。
圖12 用Celigo進(jìn)行腫瘤球體分析。從MCF10DCIS.COM細(xì)胞（MCF10A細(xì)胞系的癌變前克?。┑玫降姆指詈蟮脑糾ammosphere的實(shí)時(shí)圖像。
圖13 用Celigo分析藥物處理過的腫瘤球體。上圖是人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，下圖是人乳腺癌細(xì)胞。
（七）細(xì)胞分泌分析（Cell Secretion Analysis）
Celigo可用于快速和準(zhǔn)確地監(jiān)控生物醫(yī)藥細(xì)胞系隨時(shí)間的分泌速率，這在維持細(xì)胞系的生產(chǎn)水平方面是十分關(guān)鍵的。Celigo在細(xì)胞分泌方面的應(yīng)用可測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的蛋白分泌量，如生產(chǎn)抗體的雜交瘤細(xì)胞。這種單個(gè)細(xì)胞水平的數(shù)據(jù)不僅可以提供有價(jià)值的對(duì)整體生產(chǎn)水平的深入了解，還可以提供對(duì)細(xì)胞系的均一性的深入了解，而均一性是開發(fā)新細(xì)胞系的重要選擇標(biāo)準(zhǔn)。此應(yīng)用利用Cyntellect的專利性的分泌分析法來檢測(cè)和定量熒光標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞周圍的“分泌環(huán)（Secretion Halo）”。
用Celigo檢測(cè)細(xì)胞分泌有如下優(yōu)勢(shì)：
1）有易于使用的界面，來確定分泌細(xì)胞和報(bào)告統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；
2）可報(bào)告每個(gè)孔中的分泌細(xì)胞的數(shù)量和百分比；
3）可報(bào)告細(xì)胞分泌信號(hào)的平均強(qiáng)度和累積強(qiáng)度；
4）可分析細(xì)胞群的均一性；
5）可平行處理大量的樣品。
圖14 左圖是細(xì)胞分泌實(shí)驗(yàn)的示例。右圖顯示的是進(jìn)行細(xì)胞分泌實(shí)驗(yàn)的形成分泌圈的CHO-S細(xì)胞的典型圖像。綠色和黃色的熒光表示CHO-S細(xì)胞，而外圍的紅色熒光表示分泌出的蛋白質(zhì)（IgG）。
圖15 左圖表示用Celigo進(jìn)行的細(xì)胞分泌分析。右圖表示對(duì)應(yīng)的圖像分割，綠色分割表示THB-5細(xì)胞，黃色分割表示分泌圈。
（八）克隆確認(rèn)和擴(kuò)張（Clonal Validation & Expansion）
克隆形成的確認(rèn)是生物醫(yī)藥細(xì)胞系繁殖的關(guān)鍵步驟。具有卓越的明亮視野成像質(zhì)量，Celigo可以可靠的捕捉到單個(gè)孔中的單個(gè)細(xì)胞，即使此細(xì)胞黏附在孔壁上，并確認(rèn)從此單個(gè)細(xì)胞可發(fā)展成一個(gè)克隆。典型的，在多孔板上進(jìn)行有限稀釋，然后在一段時(shí)間內(nèi)用Celigo進(jìn)行重復(fù)拍照。這樣，培養(yǎng)幾天后，就可觀察到克隆的生長(zhǎng)，就可能回溯得到克隆由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)而得的結(jié)論。
用Celigo進(jìn)行克隆確認(rèn)有如下優(yōu)勢(shì)：
1）能對(duì)多孔微孔板進(jìn)行快速的明亮視野掃描（384-孔微孔板的掃描耗時(shí)＜5min）；
2）準(zhǔn)確的圖像分割，可檢測(cè)到單個(gè)孔中的單個(gè)細(xì)胞；
3）可對(duì)每孔中的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行heatmap表達(dá)；
4）可生成監(jiān)控細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)跟蹤報(bào)告；
5）能對(duì)圖像和數(shù)據(jù)進(jìn)行高效的數(shù)據(jù)庫管理。
圖16 用Celigo觀察克隆擴(kuò)張。顯示的是單個(gè)的CHO-S細(xì)胞擴(kuò)展形成克隆的明亮視野圖像。
圖17 用Celigo自動(dòng)檢測(cè)單個(gè)的CHO-S細(xì)胞。左圖是單個(gè)細(xì)胞分割的典型的明亮視野圖像，右圖是顯示每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)目的heatmap。
（九）細(xì)胞周期分析（Cell Cycle Analysis）
細(xì)胞周期分析常用來篩選影響細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的化合物。Celigo允許用戶使用專門為流式細(xì)胞技術(shù)開發(fā)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行貼壁細(xì)胞的細(xì)胞周期分析。Celigo軟件的靈活的分類界面被用來確認(rèn)和定量處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞的數(shù)目。這種分析可使用單一的染料，如DAPI染料，或使用顯示DNA合成的第二個(gè)標(biāo)記物，如BrdU染料。此外，還有使用能標(biāo)記有絲分裂，如組蛋白H3磷酸化的標(biāo)記物對(duì)其進(jìn)行多元分析的潛能。
用Celigo進(jìn)行表達(dá)分析應(yīng)用有如下優(yōu)勢(shì)：
1）能類似流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry）對(duì)DNA的含量進(jìn)行柱狀圖表達(dá)（histogram representation）；
2）能用散點(diǎn)圖（scatter plot representation）表達(dá)DNA含量vs.DNA合成的色塊，以確認(rèn)細(xì)胞周期的每個(gè)階段；
3）易于使用的界面能條理化從圖像獲取到生成多孔板水平數(shù)據(jù)的應(yīng)用；
4）能靈活地命名通道，確定分割的特征，進(jìn)行細(xì)胞的分類，從而定制研究者的應(yīng)用。
圖18 用Celigo進(jìn)行細(xì)胞周期分析。用Celigo的表達(dá)分析應(yīng)用（the Expression Analysis application）確定A549細(xì)胞的細(xì)胞周期。上左圖是類似流式細(xì)胞技術(shù)的DNA含量的柱狀圖。上右圖通過表示DNA合成色塊vs.DNA含量色塊的累積強(qiáng)度，得到典型的對(duì)細(xì)胞周期的“馬蹄形”（“Horse Shoe”）可視化圖像。下左圖顯示BrdU染料和DAPI染料的2色圖像。下右圖顯示微孔板水平數(shù)據(jù)結(jié)果的heatmap，如處于S-期的細(xì)胞的百分比。
（十）多參數(shù)分類（Multiparameter Gating）
Celigo軟件提供對(duì)明亮視野圖像和熒光圖像進(jìn)行多通道分析的快速的解決方案，并可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基于強(qiáng)度和形態(tài)參數(shù)的識(shí)別。此外，一個(gè)強(qiáng)大的但又易于使用的分類界面可對(duì)細(xì)胞群進(jìn)行類似流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry）的分析。特別的，一旦熒光或明亮視野圖像被分割成多個(gè)對(duì)象，Celigo就使用基于形態(tài)或強(qiáng)度的一系列分類（gate）來定義細(xì)胞群和細(xì)胞分類，報(bào)告統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。
Celigo軟件的這種多參數(shù)分類功能有如下優(yōu)勢(shì)：
1）可定義無限多個(gè)圖表和細(xì)胞群；
2）使用柱狀圖和散點(diǎn)圖對(duì)細(xì)胞群進(jìn)行交互的，實(shí)時(shí)的分類；
3）對(duì)柱狀圖進(jìn)行多范圍和多splitter gates的分類；
4）對(duì)散點(diǎn)圖進(jìn)行四象限分類和多邊形分類；
5）運(yùn)用全套的布爾算子（Boolean operators）綜合不同的分類；
6）可報(bào)告所有孔的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，確認(rèn)細(xì)胞分類。
圖19 Celigo的分類界面。在對(duì)明亮視野圖像和熒光圖像進(jìn)行分析之后，Celigo軟件可用柱狀圖（上左圖）和散點(diǎn)圖（下圖）表達(dá)分割數(shù)據(jù)?？纱_認(rèn)無限多個(gè)圖表（plots），分類（gates）和細(xì)胞群，細(xì)胞可以用顏色覆蓋（color overlay）方法進(jìn)行分類（上右圖）。
（十一）標(biāo)記物分析（Marker Analysis）
用Celigo可以準(zhǔn)確定量分析轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞信號(hào)和細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)。Celigo為研究者提供了獨(dú)特的對(duì)明亮視野和熒光成像、圖像分割、分析工具的綜合功能，來快速評(píng)估常見的免疫細(xì)胞化學(xué)染色和進(jìn)行高通量篩選。實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行多元檢測(cè)，并同時(shí)定量多種標(biāo)記物。雖然微孔中的二次抽樣（subsampling）可用于準(zhǔn)確分析單個(gè)的細(xì)胞，全孔的影像也是必須的，以準(zhǔn)確分析克隆，如干細(xì)胞克隆，的標(biāo)記物表達(dá)。
用Celigo進(jìn)行標(biāo)記物分析有如下優(yōu)勢(shì)：
1）可對(duì)多孔的微孔板進(jìn)行全孔成像和分析（掃描和分析整個(gè)96-孔微孔板耗時(shí)＜16min）；
2）易于使用的界面可對(duì)大量的細(xì)胞類型上的標(biāo)記物進(jìn)行成像和分析；
3）先進(jìn)的類流式分類（flow-like gating）界面可支持亞群（subpopulation）的分析；
4）可分析細(xì)胞和克隆的標(biāo)記物表達(dá)；
5）可對(duì)分析和定量結(jié)果進(jìn)行微孔板水平的概述。
圖20 用Celigo進(jìn)行標(biāo)記物分析。上圖是用SSEA4染色的matrigel上的hiPSCs圖像，下圖是用表達(dá)分析應(yīng)用（the Expression Analysis application）進(jìn)行分割后的圖像。細(xì)胞核被分割成mask，SSEA4陽性的細(xì)胞核被分割成目標(biāo)物，來決定表達(dá)SSEA4的細(xì)胞的百分比。
圖21 用Celigo分析細(xì)胞核標(biāo)記物的表達(dá)。上圖和左下圖是用KLF4染色的reprogrammed成纖維細(xì)胞的圖像，右下圖是用表達(dá)分析應(yīng)用（the Expression Analysis application）進(jìn)行分割后的圖像。
（十二）轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)的優(yōu)化（Transfection & Transduction Optimization）
Celigo可優(yōu)化細(xì)胞轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括如何選擇實(shí)驗(yàn)條件、決定合時(shí)的質(zhì)粒/病毒量，評(píng)估轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)目標(biāo)結(jié)構(gòu)的的最佳時(shí)間。運(yùn)用Celigo的熒光報(bào)告子和非破壞性原位成像技術(shù)，這些參數(shù)可通過在一段時(shí)間內(nèi)重復(fù)拍攝一組微孔或flask進(jìn)行快速優(yōu)化。準(zhǔn)確的全孔明亮視野細(xì)胞計(jì)數(shù)可生成用絕對(duì)細(xì)胞數(shù)目標(biāo)準(zhǔn)化的基于細(xì)胞的數(shù)據(jù)。
Celigo的基于細(xì)胞的熒光定量性能（cell-based fluorescence quantification）有如下優(yōu)勢(shì)：
1）可對(duì)轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行快速的、全孔的分析（從1536-孔到6-孔微孔板）；
2）可快速確認(rèn)高效率轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)的最優(yōu)參數(shù)；
3）利用實(shí)時(shí)成像確定短時(shí)的和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)；
4）通過對(duì)同一個(gè)微孔或flask進(jìn)行重復(fù)成像，可以生成時(shí)間進(jìn)程數(shù)據(jù)；
5）可評(píng)估抗生素誘導(dǎo)的表達(dá)和抗生素的選擇方法；
6）可對(duì)很多不同的貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞類型進(jìn)行可靠分析。
圖22 用Celigo獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)后的成纖維細(xì)胞。左圖是12-孔微孔板中的實(shí)時(shí)全孔圖像，右圖是放大的用GFP慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的人包皮成纖維細(xì)胞圖像。
圖23 用Celigo對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的成纖維細(xì)胞進(jìn)行分割。用表達(dá)分析應(yīng)用（the Expression Analysis application）對(duì)分割進(jìn)行實(shí)時(shí)成像。細(xì)胞核被分割成mask（左圖），而GFP-陽性的細(xì)胞核被分割成目標(biāo)（右圖）來決定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
圖24 用Celigo進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)優(yōu)化。用Celigo獲取和分析人包皮成纖維細(xì)胞用不同劑量的GFP慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的圖像和圖像分析。
（十三）干細(xì)胞特征描述（Stem Cell Characterization）
用Celigo可以快速掃描和評(píng)估在任何標(biāo)準(zhǔn)微孔板里生長(zhǎng)的干細(xì)胞，極大地減少了描述這些復(fù)雜的培養(yǎng)物的時(shí)間和精力?？煽焖佾@得全孔的明亮視野和/或熒光圖像，以分析干細(xì)胞培養(yǎng)的健康狀況，分化狀態(tài)和splitting倍數(shù)/比率。Celigo也可用于評(píng)估與干細(xì)胞聯(lián)合的蛋白質(zhì)的表達(dá)。可通過在一段時(shí)間內(nèi)重復(fù)拍攝相同的微孔板觀察培養(yǎng)物隨時(shí)間的變化，來監(jiān)控reprogramming和分化（differentiation）的進(jìn)程。
用Celigo進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)分析具有如下優(yōu)勢(shì)：
1）可對(duì)干細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行快速的、全孔的成像（從96-孔到6-孔微孔板，掃描整個(gè)6-孔微孔板的時(shí)間大約是10min）；
2）可獲得明亮視野和多達(dá)3個(gè)熒光通道的圖像；
3）可跟蹤活的干細(xì)胞培養(yǎng)物來分析分化狀態(tài)；
4）可分析活的和固定的干細(xì)胞的染色類型；
5）可消除用傳統(tǒng)的顯微鏡收集和分析圖像的繁重的勞動(dòng)。
圖25 用Celigo進(jìn)行干細(xì)胞的特征描述。左圖是6-孔微孔板的全孔圖像，中圖和右圖是用特征性的干細(xì)胞標(biāo)記物染色的hiPSCs細(xì)胞的放大圖像。
圖26 用Celigo記錄隨時(shí)間進(jìn)行的reprogramming。顯示reprogrammed人成纖維細(xì)胞的實(shí)時(shí)全孔圖像（12-孔微孔板）。
（十四）感染性實(shí)驗(yàn)（Infectivity Assay）
用Celigo可以快速評(píng)估細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic Effect，CPE），即因?yàn)榧膊「腥疽鸬募?xì)胞的退行性改變，包括細(xì)胞變圓，膨脹/收縮和顆粒狀。使用明亮視野、全孔成像、自動(dòng)化分割和分析，Celigo提供基于宿主細(xì)胞單層特征變化的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的定量描述?？衫枚嗫孜⒖装宥勘徊煌味炔《靖腥镜闹貜?fù)樣品，以獲得可靠的結(jié)果。
Celigo提供如下優(yōu)勢(shì)：
1）個(gè)體分割和分析對(duì)感染的程度（magnitude of infection，MOI）提供定量的分析；
2）自動(dòng)化的樣品分析可減少時(shí)間、勞力和變異性；
3）高通量和可放大：分析96-孔或384-孔微孔板的耗時(shí)＜10min；
4）可拍攝高分辨率的全孔圖像，以便進(jìn)行文件化（documentation），跟蹤（audit trail）或手動(dòng)評(píng)估細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）；
5）支持基于熒光的與感染性相關(guān)的多功能實(shí)驗(yàn)（如表達(dá)分析，凋亡）。
圖27 用Celigo觀察的感染性實(shí)驗(yàn)。表示不同感染程度的哺乳細(xì)胞的實(shí)時(shí)圖像。用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和飽和度法分析感染程度（MOI）。
圖28 用Celigo得到的典型heatmap。顯示BVD感染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，無感染孔為綠色，感染孔為紅色。
（十五）基于細(xì)胞形態(tài)的篩選（Morphology Based Screening）
使用Celigo可以準(zhǔn)確定量藥物篩選中廣泛使用的對(duì)化合物的細(xì)胞毒性的評(píng)估。細(xì)胞形態(tài)的改變是細(xì)胞健康性的標(biāo)志，可用來確定潛在的候選藥物。Celigo可在原位對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行快速和無標(biāo)記的成像，并定量形態(tài)參數(shù)。明亮視野成像分割算法可基于細(xì)胞的形態(tài)確認(rèn)細(xì)胞，并將它們按照相似的形態(tài)進(jìn)行分類。因?yàn)檫@些形態(tài)學(xué)工具無需使用任何標(biāo)記，所以細(xì)胞可在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行重新成像和分析，并進(jìn)行大量的形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)潛在的藥物作用。
Celigo的明亮視野成像具有如下優(yōu)勢(shì)：
1）可進(jìn)行快速和無標(biāo)記的明亮視野獲取和分析；
2）可開發(fā)基于形態(tài)計(jì)量的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；
3）可基于細(xì)胞形態(tài)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和分類；
4）易于使用的界面可獲取和分析圖像。
圖29 用Celigo進(jìn)行基于細(xì)胞形態(tài)的篩選。DU145前列腺癌細(xì)胞的明亮視野圖像被分割成圓形、扁形或所有細(xì)胞。對(duì)照孔中的細(xì)胞（上圖）大多數(shù)是扁形的，圓形細(xì)胞的百分比很少。藥物處理孔中用Celastrol處理的細(xì)胞（下圖）變得更圓，并有高百分比的圓形細(xì)胞。
（十六）高通量篩選（High-Throughput Screening）
利用大視野光學(xué)元件和專利的高速成像系統(tǒng)，Celigo無需移動(dòng)微孔板就可以進(jìn)行多視野成像。幾乎所有的微孔板型號(hào)（從6-孔到1536-孔微孔板）都可以在明亮視野（brightfield）和3通道熒光通道中進(jìn)行全孔成像或部分成像。獨(dú)特的明亮視野光學(xué)元件能對(duì)處在孔邊緣的細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的分割。定量的基于細(xì)胞和/或基于微孔的數(shù)據(jù)可在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行管理、實(shí)驗(yàn)分析和解析。
用Celigo進(jìn)行高通量成像具有如下優(yōu)勢(shì)：
1）很快速的掃描（掃描384-孔微孔板耗時(shí)＜5min）；
2）軟件可直接對(duì)圖像進(jìn)行分割；
3）和機(jī)械臂裝載系統(tǒng)完全兼容；
4）先進(jìn)的類流式分類（flow-like gating）界面可支持亞群（subpopulation）分析；
5）準(zhǔn)確的、全孔的明亮視野細(xì)胞計(jì)數(shù)可用于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖30 用Celigo對(duì)1536-孔微孔板進(jìn)行基于細(xì)胞的篩選。HeLa細(xì)胞表達(dá)tuboGFP或FP602。
圖31 結(jié)果輸出選項(xiàng)包括能快速顯示趨勢(shì)和異常值的heatmap。
（十七）方法學(xué)發(fā)展（Assay Development）
Celigo的靈活性和易于使用性方便了基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化和隨后的對(duì)實(shí)驗(yàn)性能的評(píng)估?？赏ㄟ^先在一種微孔板上實(shí)驗(yàn)，再完美地轉(zhuǎn)移到更高密度的微孔板，如384-孔或1536-孔微孔板上進(jìn)行方法的開發(fā)，并使用同樣的儀器進(jìn)行驗(yàn)證。Celigo的3色熒光通道和明亮視野，可用來在全孔中準(zhǔn)確標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞的數(shù)目，豐富的類流式細(xì)胞儀的分類界面可進(jìn)行大量的基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，并且在解決實(shí)驗(yàn)問題方面是極為有用的。
Celigo的方法學(xué)發(fā)展有如下優(yōu)勢(shì)：
1）簡(jiǎn)單易懂的細(xì)胞分割軟件；
2）結(jié)合布爾算子的類流式細(xì)胞儀的分類（flow cytometry-like gating）界面可進(jìn)行細(xì)胞分類；
3）特殊的算法可分析多細(xì)胞結(jié)構(gòu)；
4）支持多用戶使用；
5）支持多孔微孔板（從1536-孔到6-孔微孔板）和T-flask（T-25和T-75）；
6）數(shù)據(jù)庫可高效管理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
圖32 Celigo的成像多樣性。成像實(shí)驗(yàn)可在不同微孔板類型中完美轉(zhuǎn)移，如6-孔，96-孔和1536-孔微孔板。
圖33 Celigo分類界面可分析細(xì)胞的亞群。散點(diǎn)圖（左圖）可用來將桔黃色細(xì)胞從綠色細(xì)胞（右圖）中分離開來，以便進(jìn)一步分析。
Celigo細(xì)胞分析儀應(yīng)用總結(jié)；
（一）細(xì)胞培養(yǎng)管理（Cell Culture Management）：細(xì)胞計(jì)數(shù)；飽和度計(jì)算；
（二）細(xì)胞計(jì)數(shù)（Cell Cytometry）：細(xì)胞計(jì)數(shù)；標(biāo)記物分析；基于細(xì)胞形態(tài)的篩選；多參數(shù)分類；
（三）基于細(xì)胞的篩選（Cell-Based Screening）：方法學(xué)發(fā)展；細(xì)胞系的特征描述；高通量篩選；標(biāo)記物分析；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)；轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)的優(yōu)化；
（四）生物藥學(xué)細(xì)胞系的開發(fā)（Biopharmaceutical Cell Line Development）：細(xì)胞健康狀況評(píng)估；細(xì)胞分泌分析；克隆確認(rèn)和擴(kuò)張；
（五）癌癥研究（Cancer Research)：細(xì)胞周期分析；非標(biāo)記的生長(zhǎng)跟蹤；基于細(xì)胞形態(tài)的篩選；多參數(shù)分類；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)；腫瘤球體分析；
（六）干細(xì)胞研究（Stem Cell Research）：干細(xì)胞特征描述
（七）細(xì)胞毒性研究（Toxicology）：細(xì)胞健康狀況評(píng)估；感染性實(shí)驗(yàn)；基于細(xì)胞形態(tài)的篩選。
Celigo細(xì)胞儀的參數(shù)設(shè)置
（一）實(shí)驗(yàn)器具類型
1）1536-、384-、96-、24-和6-孔微孔板；
2）T-25和T-75 flasks。
（二）掃描時(shí)間
1）掃描整個(gè)微孔板僅耗時(shí)5-15min。
（三）分辨率
1）1µm/像素；0.25 NA全分辨率（可選擇2 x 2 binning mode）。
（四）檢測(cè)器
1）CCD（2052 x 2052像素）；
（五）檢測(cè)模式
1）基于LED的改進(jìn)的明亮視野成像，對(duì)整個(gè)孔有均勻一致的照明度；
2）基于LED的熒光成像，帶3個(gè)激發(fā)和發(fā)射濾光片組。
（六）熒光檢測(cè)范圍
1）除了明亮視野，還有3個(gè)激發(fā)和發(fā)射濾光片，共提供4個(gè)成像通道；
2）熒光波長(zhǎng)包括：
|
通道 |
激發(fā)光 |
發(fā)射光 |
常用染料 |
|
1-藍(lán)光 |
377 |
447 |
Hoechst，DAPI |
|
2-綠光 |
483 |
536 |
FITC，Calcein，Alexa488 |
|
3-紅光 |
531 |
629 |
PI，Texas Red，Alexa568 |
（七）對(duì)焦功能
1）有基于圖像的自動(dòng)對(duì)焦功能和快速的獨(dú)立于圖像的自動(dòng)對(duì)焦功能。
（八）計(jì)算機(jī)硬件
1）Dell Precision T3500或相似的配置；
2）可用USB 3.0外部驅(qū)動(dòng)進(jìn)行額外的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)。
（九）軟件輸出
1）圖像輸出文件格式：TIFF，JPEG，BMP；
2）數(shù)據(jù)庫存儲(chǔ)的圖像格式：JPEG2000。
（十）尺寸
1）尺寸：19” X 25” X 20” (48 cm x 64 cm x 51 cm)；
2）重量：117磅（53kg）。
（十一）電源
1）110-220 VAC 50-60 Hz（需要3相電源插座）。
