我們知道目前生命科學(xué)及現(xiàn)代分子生物學(xué)主要集中在對(duì)核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的分析以及進(jìn)行一些細(xì)胞水平的研究。傳統(tǒng)的分析方法是采用放射性同位素作為一種示蹤劑，標(biāo)記在各種生物大分子或者細(xì)胞中來(lái)研究它們之間的相互作用和變化，但是放射性同位素對(duì)環(huán)境具有一定的破壞性，對(duì)人體健康也具有一定的損害，所以各國(guó)的科學(xué)家都致力于研究和應(yīng)用高靈敏度的非同位素檢測(cè)方法，利用熒光探針作為一種標(biāo)記物，以其自身的一些優(yōu)勢(shì)而得到廣泛的應(yīng)用。目前對(duì)熒光進(jìn)行檢測(cè)的儀器種類(lèi)很多，例如我們常見(jiàn)的熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、多功能讀板儀（酶標(biāo)儀）等，普通的熒光顯微鏡只能觀察物質(zhì)形態(tài)，不能給出量化指標(biāo)，而流式細(xì)胞儀又因其價(jià)格昂貴和操作復(fù)雜不能得到廣泛的應(yīng)用。酶標(biāo)儀作為一種熒光信號(hào)檢測(cè)儀器，具有很多優(yōu)勢(shì)，不但價(jià)錢(qián)便宜、個(gè)頭小、操作簡(jiǎn)便，而且還可以根據(jù)熒光信號(hào)特點(diǎn)和強(qiáng)弱來(lái)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析。目前市面上支持熒光檢測(cè)的多功能酶標(biāo)儀種類(lèi)很多，例如Molecular Devices的SpectraMax系列的M2，M3，M4和M5，和目前市面上唯一一款可以完成快速動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的Flexstation 3等。

 

 

熒光探針（熒光染料分子）在光的照射下，物質(zhì)的電子吸收能量后，可由低能級(jí)的電子層（內(nèi)電子層）跳到高能級(jí)的電子層。此時(shí)，電子由低能態(tài)進(jìn)入高能態(tài)。高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，他會(huì)在極短的時(shí)間（10-8s）內(nèi)，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來(lái)的能態(tài)。這時(shí)發(fā)射出的波長(zhǎng)比激發(fā)光的波長(zhǎng)要長(zhǎng)，如果在可見(jiàn)光波長(zhǎng)的范圍內(nèi)，為人眼所能看見(jiàn)的光，這種光稱(chēng)之為熒光。熒光是發(fā)光體分子中處于激發(fā)態(tài)的原子核外電子由高能級(jí)回到低能級(jí)所產(chǎn)生的輻射，因此是冷光。熒光的顏色多為藍(lán)色、綠色、紅色和黃色等。

 

 

熒光檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、動(dòng)態(tài)范圍寬、無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)；但也易受到反應(yīng)體系中PH值和環(huán)境溫度的影響，另外如熒光淬滅、光漂白等現(xiàn)象也會(huì)對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)產(chǎn)生較大的影響。

 

我們可以根據(jù)熒光探針?lè)肿犹匦裕ò胨テ诓煌晒鈾z測(cè)技術(shù)分為熒光強(qiáng)度（FI）和時(shí)間分辨熒光（TRF）兩大類(lèi)。

 

 

熒光強(qiáng)度即發(fā)射熒光的光量子數(shù)，熒光強(qiáng)度決定了熒光色素檢測(cè)的靈敏度。利用熒光強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)定性：即不同的熒光物質(zhì)有不同的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，因此可用熒光進(jìn)行物質(zhì)的鑒別。也可進(jìn)行物質(zhì)的定量測(cè)定：利用在較低濃度下熒光強(qiáng)度與樣品濃度成正比這一關(guān)系可以定量分析樣品中熒光組分的含量。熒光強(qiáng)度檢測(cè)技術(shù)在生物學(xué)上的應(yīng)用非常廣泛，可以進(jìn)行生物大分子定量、酶活性分析、熒光免疫分析、細(xì)胞學(xué)分析（細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒理、細(xì)胞吸附等）、胞內(nèi)鈣離子濃度的變化、熒光蛋白的報(bào)道基因分析 (GFP)、細(xì)胞凋亡等。

 

 

目前細(xì)胞增殖檢測(cè)普遍采用MTT方法，其原理是活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，DMSO溶解后，酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，此法可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。但是其步驟比較繁瑣，且MTT對(duì)人有致癌性。所以熒光檢測(cè)方法以其自身許多優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越得到大家青睞，以（Invitrogen）CyQuant細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒為例,其為一種綠色熒光探針，能與細(xì)胞裂解液中的核酸特異結(jié)合,其檢測(cè)靈敏度可達(dá)50cell-50000cell/200ul，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程是免洗的，適合高通量實(shí)驗(yàn)，并且不易受到細(xì)胞培養(yǎng)液中血清等成分干擾。

 

鈣離子是機(jī)體的重要元素，作為細(xì)胞內(nèi)第二信使通過(guò)與鈣調(diào)蛋白結(jié)合激活多種蛋白激酶（如腺苷酸環(huán)化酶、磷酸二酯酶、鈣調(diào)蛋白激酶等）及諸多蛋白水解酶和核酸酶，從而參與包括細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞的許多生命活動(dòng)中擔(dān)當(dāng)著重要的角色。傳統(tǒng)的 Fura-2，indo-1，Quin-2是Ca2+熒光指示劑，可以反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，當(dāng)結(jié)合鈣離子時(shí)，最大激發(fā)波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生改變，發(fā)射熒光的強(qiáng)度和結(jié)合的Ca2+濃度有著定量的關(guān)系，但是這些鈣流檢測(cè)試劑有其自身一些缺點(diǎn)，首先整個(gè)反應(yīng)過(guò)程需要水洗，不適合高通量實(shí)驗(yàn)要求，其二對(duì)溫度敏感，光穩(wěn)定性差。Molecular Devices針對(duì)于鈣流檢測(cè)特點(diǎn)推出了一系列檢測(cè)試劑盒，首先采用專(zhuān)利的quanch技術(shù)，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程不需要水洗，增加檢測(cè)通量，其次采用特殊的熒光探針，與鈣離子結(jié)合后其穩(wěn)定性較好，熒光信號(hào)強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)得到很多實(shí)驗(yàn)者的肯定。

 

 

近幾年在生命科學(xué)研究中，GFP（一種水母中提取的綠色熒光蛋白）作為一種報(bào)告基因以其自身的許多優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到大家重視，首先GFP無(wú)毒，自身在不需要輔酶作用下可以發(fā)光，且熒光信號(hào)穩(wěn)定。我們可以用目的基因與GFP基因融合，轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)確定其表達(dá)量的高低。

 

 

時(shí)間分辨熒光（TRF）實(shí)際上是在熒光強(qiáng)度（FI）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，它是一種特殊的熒光分析。熒光分析利用了熒光的波長(zhǎng)與其激發(fā)波長(zhǎng)的巨大差異克服了普通紫外－可見(jiàn)分光分析法中雜色光的影響，同時(shí)，熒光分析與普通分光不同，光電接受器與激發(fā)光不在同一直線(xiàn)上，激發(fā)光不能直接到達(dá)光電接受器，從而大幅度的提高了光學(xué)分析的靈敏度。但是，當(dāng)進(jìn)行超微量分析的時(shí)候，激發(fā)光的雜散光的影響就顯得嚴(yán)重了。因此，解決激發(fā)光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。

解決雜散光影響的最好方法當(dāng)然是測(cè)量時(shí)沒(méi)有激發(fā)光的存在。但普通的熒光標(biāo)志物熒光壽命非常短，激發(fā)光消失，熒光也消失。不過(guò)稀土元素（Eu、Tb、Sm、Dy)的三價(jià)離子的電子云的結(jié)構(gòu)會(huì)一定程度上限制了電子的遷移，導(dǎo)致這類(lèi)元素發(fā)生的熒光的衰減周期通常是很長(zhǎng)，能達(dá)到1-2ms，可以滿(mǎn)足測(cè)量要求，因此而產(chǎn)生了時(shí)間分辨熒光分析法，即使用長(zhǎng)效熒光標(biāo)記物，在關(guān)閉激發(fā)光后再測(cè)定熒光強(qiáng)度的分析方法。平時(shí)常用于時(shí)間分辨熒光檢測(cè)的探針為Eu(銪）和Tb(鋱）。時(shí)間分辨熒光檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、檢測(cè)重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍寬等優(yōu)勢(shì)，適用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)的微量分析，如細(xì)胞因子檢測(cè)、抗體檢測(cè)、病毒抗原分析以及藥物代謝分析等。

隨著人們對(duì)食品安全的要求越來(lái)越高，國(guó)際社會(huì)上對(duì)食品中有毒有害物質(zhì)的檢測(cè)越來(lái)越嚴(yán)格，各種有毒有害物質(zhì)的限量標(biāo)準(zhǔn)也在不斷提高，時(shí)間分辨熒光免疫分析方法也可用于快速檢測(cè)食品中的大腸桿菌O157:H7、赭曲霉毒素A 、微囊藻毒素和有害金屬等。相信隨著多功能酶標(biāo)儀廣泛的應(yīng)用和各種檢測(cè)試劑盒的不斷開(kāi)發(fā)，時(shí)間分辨免疫分析技術(shù)將在食品安全領(lǐng)域發(fā)揮更強(qiáng)大的作用。

 

 

綜上所述，利用熒光探針作為檢測(cè)手段具有很多優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越多的基于其原理的檢測(cè)試劑盒問(wèn)世。如何能更好的提高其檢測(cè)的靈敏度和線(xiàn)性范圍，降低其背景值，提高信噪比呢？

 

優(yōu)化檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵技術(shù)之一，酶標(biāo)儀的核心部件單色器，主要作用是從波長(zhǎng)范圍寬廣的光線(xiàn)中，分出波段較窄的單色光的裝置。問(wèn)世最早的是濾片型酶標(biāo)儀，其配合二向色鏡（其實(shí)也就是另一模式的濾光反光濾鏡）等光路系統(tǒng)，可以滿(mǎn)足大部分實(shí)驗(yàn)的需要。但是隨著實(shí)驗(yàn)類(lèi)型變化和檢測(cè)需求不斷提高，有時(shí)需要對(duì)激發(fā)和發(fā)射光譜進(jìn)行研究，濾光片型酶標(biāo)儀由于其濾片的數(shù)目限制，不能達(dá)到要求，故隨之誕生了光柵型的儀器。第一臺(tái)光柵型酶標(biāo)儀是由Molecular Devices推出的，其在激發(fā)光和發(fā)射光處各有一個(gè)光柵，但是考慮到光純度不夠，所以在激發(fā)光柵和發(fā)射光柵的后面又加入了一組帶阻濾光片，對(duì)雜光進(jìn)行二次過(guò)濾，其結(jié)果基本與純粹的濾光片系統(tǒng)一致。Molecular Devices的這項(xiàng)專(zhuān)利技術(shù)受到保護(hù)后，其它很多酶標(biāo)儀廠家在光柵型酶標(biāo)儀上面只能采用雙光柵系統(tǒng)來(lái)提高光純度，降低雜光率，即激發(fā)和發(fā)射各用了一組光柵，整個(gè)光路系統(tǒng)共四個(gè)光柵，所以也稱(chēng)四光柵型酶標(biāo)儀，雖然也能提高其對(duì)雜光過(guò)濾，但是由于多了一組光柵作用后，其光強(qiáng)度損失較大，檢測(cè)的靈敏度也會(huì)受到影響。

 

優(yōu)化檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵技術(shù)之二，光源選擇，不同的單色器對(duì)光的透射率不同，會(huì)影響檢測(cè)靈敏度，那么光源本身強(qiáng)度高低也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的影響，目前酶標(biāo)儀比較普遍使用的光源分別為普通氙閃燈、高能氙閃燈和鹵素?zé)舻?。LED燈作為一種新光源以其自身許多優(yōu)勢(shì)慢慢被許多酶標(biāo)儀所采用，我們知道在同等效率下，LED燈壽命是傳統(tǒng)鹵素?zé)舻?0倍，免去了頻繁的更換燈泡和等待燈泡預(yù)熱所帶來(lái)的麻煩，其光源能量強(qiáng)、穩(wěn)定性好，所以有助于提高熒光檢測(cè)的靈敏度。

 

傳統(tǒng)酶標(biāo)儀是采用光路系統(tǒng)和檢測(cè)器系統(tǒng)一體式設(shè)計(jì)模式，模塊出廠就已經(jīng)固定，不可以進(jìn)行功能上的升級(jí)。市場(chǎng)上需要一種用戶(hù)可根據(jù)自己的要求進(jìn)行隨意升級(jí)的多功能酶標(biāo)儀，Molecular Devices針對(duì)市場(chǎng)需求推出了一款名為Paradigm多功能酶標(biāo)儀。它將光源系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)獨(dú)立分開(kāi)，多套檢測(cè)器固定在主機(jī)上，針對(duì)不同實(shí)驗(yàn)要求選用不同的卡盒，每一種卡盒其實(shí)就是獨(dú)立的光路系統(tǒng)，例如光吸收實(shí)驗(yàn)在波長(zhǎng)靈活性上要求較高，那么針對(duì)這樣的要求，光吸收卡盒采用光柵作為其單色器；針對(duì)于AlphaSreen 要求的特殊性，卡盒也采用了激光作為其光源，保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

 

Tune卡盒的推出被認(rèn)為是酶標(biāo)儀發(fā)展技術(shù)上又一次劃時(shí)代的突破，它是集熒光強(qiáng)度、化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨熒光三功能為一體的卡盒。首先它采用了高能AUTO-LED燈作為其光源，不但增加檢測(cè)靈敏度，而且還可以增加其檢測(cè)線(xiàn)性范圍，傳統(tǒng)酶標(biāo)儀針對(duì)不同強(qiáng)度的熒光信號(hào)采用在PMT（光電倍增管）進(jìn)行調(diào)節(jié)，熒光強(qiáng)度檢測(cè)線(xiàn)性范圍一般在4至5個(gè)數(shù)量級(jí)，采用了AUTO-LED燈可以使檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍增加至6至7個(gè)數(shù)量級(jí)。其次它將兩種不同單色器的優(yōu)勢(shì)整合為一體，采用了一種全新的濾光片可調(diào)式技術(shù)，也就是既有光柵型單色器的靈活性（1nm光波可調(diào)），又保留了濾光片型單色器的光透率強(qiáng)的特點(diǎn)。這樣熒光強(qiáng)度和時(shí)間分辨熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)上，既增加其檢測(cè)的靈活性又增加檢測(cè)的靈敏度，有數(shù)據(jù)表明Tune卡盒在熒光檢測(cè)方面其靈敏度較光柵型單色器高10倍以上。

Molecular Devices一直以客戶(hù)需求作為其研發(fā)重點(diǎn)，Paradigm多功能酶標(biāo)儀和Tune多功能卡盒的推出就很好的證明了這一點(diǎn)，針對(duì)未來(lái)不同實(shí)驗(yàn)的不同要求，Molecular Devices將會(huì)推出針對(duì)其新檢測(cè)方法的卡盒來(lái)更好的滿(mǎn)足用戶(hù)的需要。