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淺談熒光在酶標(biāo)儀上的應(yīng)用以及新一代酶標(biāo)檢測(cè)系統(tǒng)(Paradigm+Tune)的優(yōu)勢(shì)

   2024-12-23 美谷分子儀器(上海)有限公司1653
 
前言
        我們知道目前生命科學(xué)及現(xiàn)代分子生物學(xué)主要集中在對(duì)核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的分析以及進(jìn)行一些細(xì)胞水平的研究。傳統(tǒng)的分析方法是采用放射性同位素作為一種示蹤劑,標(biāo)記在各種生物大分子或者細(xì)胞中來(lái)研究它們之間的相互作用和變化,但是放射性同位素對(duì)環(huán)境具有一定的破壞性,對(duì)人體健康也具有一定的損害,所以各國(guó)的科學(xué)家都致力于研究和應(yīng)用高靈敏度的非同位素檢測(cè)方法,利用熒光探針作為一種標(biāo)記物,以其自身的一些優(yōu)勢(shì)而得到廣泛的應(yīng)用。目前對(duì)熒光進(jìn)行檢測(cè)的儀器種類很多,例如我們常見的熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、多功能讀板儀(酶標(biāo)儀)等,普通的熒光顯微鏡只能觀察物質(zhì)形態(tài),不能給出量化指標(biāo),而流式細(xì)胞儀又因其價(jià)格昂貴和操作復(fù)雜不能得到廣泛的應(yīng)用。酶標(biāo)儀作為一種熒光信號(hào)檢測(cè)儀器,具有很多優(yōu)勢(shì),不但價(jià)錢便宜、個(gè)頭小、操作簡(jiǎn)便,而且還可以根據(jù)熒光信號(hào)特點(diǎn)和強(qiáng)弱來(lái)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析。目前市面上支持熒光檢測(cè)的多功能酶標(biāo)儀種類很多,例如Molecular Devices的SpectraMax系列的M2,M3,M4和M5,和目前市面上唯一一款可以完成快速動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的Flexstation 3等。
 
熒光產(chǎn)生機(jī)理
 
熒光探針(熒光染料分子)在光的照射下,物質(zhì)的電子吸收能量后,可由低能級(jí)的電子層(內(nèi)電子層)跳到高能級(jí)的電子層。此時(shí),電子由低能態(tài)進(jìn)入高能態(tài)。高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的,他會(huì)在極短的時(shí)間(10-8s)內(nèi),以輻射光量子的形式釋放能量后,再回到原來(lái)的能態(tài)。這時(shí)發(fā)射出的波長(zhǎng)比激發(fā)光的波長(zhǎng)要長(zhǎng),如果在可見光波長(zhǎng)的范圍內(nèi),為人眼所能看見的光,這種光稱之為熒光。熒光是發(fā)光體分子中處于激發(fā)態(tài)的原子核外電子由高能級(jí)回到低能級(jí)所產(chǎn)生的輻射,因此是冷光。熒光的顏色多為藍(lán)色、綠色、紅色和黃色等。
 
熒光檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)和影響因素
 
熒光檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、動(dòng)態(tài)范圍寬、無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn);但也易受到反應(yīng)體系中PH值和環(huán)境溫度的影響,另外如熒光淬滅、光漂白等現(xiàn)象也會(huì)對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)產(chǎn)生較大的影響。
 
我們可以根據(jù)熒光探針分子特性(半衰期不同)將熒光檢測(cè)技術(shù)分為熒光強(qiáng)度(FI)和時(shí)間分辨熒光(TRF)兩大類。
 
熒光強(qiáng)度(FI)
 
熒光強(qiáng)度即發(fā)射熒光的光量子數(shù),熒光強(qiáng)度決定了熒光色素檢測(cè)的靈敏度。利用熒光強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)定性:即不同的熒光物質(zhì)有不同的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,因此可用熒光進(jìn)行物質(zhì)的鑒別。也可進(jìn)行物質(zhì)的定量測(cè)定:利用在較低濃度下熒光強(qiáng)度與樣品濃度成正比這一關(guān)系可以定量分析樣品中熒光組分的含量。熒光強(qiáng)度檢測(cè)技術(shù)在生物學(xué)上的應(yīng)用非常廣泛,可以進(jìn)行生物大分子定量、酶活性分析、熒光免疫分析、細(xì)胞學(xué)分析(細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒理、細(xì)胞吸附等)、胞內(nèi)鈣離子濃度的變化、熒光蛋白的報(bào)道基因分析 (GFP)、細(xì)胞凋亡等。
 
細(xì)胞增殖檢測(cè)
 
目前細(xì)胞增殖檢測(cè)普遍采用MTT方法,其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中,DMSO溶解后,酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,此法可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。但是其步驟比較繁瑣,且MTT對(duì)人有致癌性。所以熒光檢測(cè)方法以其自身許多優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越得到大家青睞,以(Invitrogen)CyQuant細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒為例,其為一種綠色熒光探針,能與細(xì)胞裂解液中的核酸特異結(jié)合,其檢測(cè)靈敏度可達(dá)50cell-50000cell/200ul,整個(gè)反應(yīng)過程是免洗的,適合高通量實(shí)驗(yàn),并且不易受到細(xì)胞培養(yǎng)液中血清等成分干擾。
 
細(xì)胞內(nèi)鈣流檢測(cè)

鈣離子是機(jī)體的重要元素,作為細(xì)胞內(nèi)第二信使通過與鈣調(diào)蛋白結(jié)合激活多種蛋白激酶(如腺苷酸環(huán)化酶、磷酸二酯酶、鈣調(diào)蛋白激酶等)及諸多蛋白水解酶和核酸酶,從而參與包括細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié),在細(xì)胞的許多生命活動(dòng)中擔(dān)當(dāng)著重要的角色。傳統(tǒng)的 Fura-2,indo-1,Quin-2是Ca2+熒光指示劑,可以反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化,當(dāng)結(jié)合鈣離子時(shí),最大激發(fā)波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生改變,發(fā)射熒光的強(qiáng)度和結(jié)合的Ca2+濃度有著定量的關(guān)系,但是這些鈣流檢測(cè)試劑有其自身一些缺點(diǎn),首先整個(gè)反應(yīng)過程需要水洗,不適合高通量實(shí)驗(yàn)要求,其二對(duì)溫度敏感,光穩(wěn)定性差。Molecular Devices針對(duì)于鈣流檢測(cè)特點(diǎn)推出了一系列檢測(cè)試劑盒,首先采用專利的quanch技術(shù),整個(gè)反應(yīng)過程不需要水洗,增加檢測(cè)通量,其次采用特殊的熒光探針,與鈣離子結(jié)合后其穩(wěn)定性較好,熒光信號(hào)強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)得到很多實(shí)驗(yàn)者的肯定。
 
熒光蛋白報(bào)告基因分析
 
近幾年在生命科學(xué)研究中,GFP(一種水母中提取的綠色熒光蛋白)作為一種報(bào)告基因以其自身的許多優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到大家重視,首先GFP無(wú)毒,自身在不需要輔酶作用下可以發(fā)光,且熒光信號(hào)穩(wěn)定。我們可以用目的基因與GFP基因融合,轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),通過熒光信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)確定其表達(dá)量的高低。
 
時(shí)間分辨熒光(TRF)
 
時(shí)間分辨熒光(TRF)實(shí)際上是在熒光強(qiáng)度(FI)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,它是一種特殊的熒光分析。熒光分析利用了熒光的波長(zhǎng)與其激發(fā)波長(zhǎng)的巨大差異克服了普通紫外-可見分光分析法中雜色光的影響,同時(shí),熒光分析與普通分光不同,光電接受器與激發(fā)光不在同一直線上,激發(fā)光不能直接到達(dá)光電接受器,從而大幅度的提高了光學(xué)分析的靈敏度。但是,當(dāng)進(jìn)行超微量分析的時(shí)候,激發(fā)光的雜散光的影響就顯得嚴(yán)重了。因此,解決激發(fā)光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。

解決雜散光影響的最好方法當(dāng)然是測(cè)量時(shí)沒有激發(fā)光的存在。但普通的熒光標(biāo)志物熒光壽命非常短,激發(fā)光消失,熒光也消失。不過稀土元素(Eu、Tb、Sm、Dy)的三價(jià)離子的電子云的結(jié)構(gòu)會(huì)一定程度上限制了電子的遷移,導(dǎo)致這類元素發(fā)生的熒光的衰減周期通常是很長(zhǎng),能達(dá)到1-2ms,可以滿足測(cè)量要求,因此而產(chǎn)生了時(shí)間分辨熒光分析法,即使用長(zhǎng)效熒光標(biāo)記物,在關(guān)閉激發(fā)光后再測(cè)定熒光強(qiáng)度的分析方法。平時(shí)常用于時(shí)間分辨熒光檢測(cè)的探針為Eu(銪)和Tb(鋱)。時(shí)間分辨熒光檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、檢測(cè)重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬等優(yōu)勢(shì),適用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)的微量分析,如細(xì)胞因子檢測(cè)、抗體檢測(cè)、病毒抗原分析以及藥物代謝分析等。

隨著人們對(duì)食品安全的要求越來(lái)越高,國(guó)際社會(huì)上對(duì)食品中有毒有害物質(zhì)的檢測(cè)越來(lái)越嚴(yán)格,各種有毒有害物質(zhì)的限量標(biāo)準(zhǔn)也在不斷提高,時(shí)間分辨熒光免疫分析方法也可用于快速檢測(cè)食品中的大腸桿菌O157:H7、赭曲霉毒素A 、微囊藻毒素和有害金屬等。相信隨著多功能酶標(biāo)儀廣泛的應(yīng)用和各種檢測(cè)試劑盒的不斷開發(fā),時(shí)間分辨免疫分析技術(shù)將在食品安全領(lǐng)域發(fā)揮更強(qiáng)大的作用。
 
熒光檢測(cè)用酶標(biāo)儀
 
綜上所述,利用熒光探針作為檢測(cè)手段具有很多優(yōu)勢(shì),越來(lái)越多的基于其原理的檢測(cè)試劑盒問世。如何能更好的提高其檢測(cè)的靈敏度和線性范圍,降低其背景值,提高信噪比呢?
 
優(yōu)化檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵技術(shù)之一,酶標(biāo)儀的核心部件單色器,主要作用是從波長(zhǎng)范圍寬廣的光線中,分出波段較窄的單色光的裝置。問世最早的是濾片型酶標(biāo)儀,其配合二向色鏡(其實(shí)也就是另一模式的濾光反光濾鏡)等光路系統(tǒng),可以滿足大部分實(shí)驗(yàn)的需要。但是隨著實(shí)驗(yàn)類型變化和檢測(cè)需求不斷提高,有時(shí)需要對(duì)激發(fā)和發(fā)射光譜進(jìn)行研究,濾光片型酶標(biāo)儀由于其濾片的數(shù)目限制,不能達(dá)到要求,故隨之誕生了光柵型的儀器。第一臺(tái)光柵型酶標(biāo)儀是由Molecular Devices推出的,其在激發(fā)光和發(fā)射光處各有一個(gè)光柵,但是考慮到光純度不夠,所以在激發(fā)光柵和發(fā)射光柵的后面又加入了一組帶阻濾光片,對(duì)雜光進(jìn)行二次過濾,其結(jié)果基本與純粹的濾光片系統(tǒng)一致。Molecular Devices的這項(xiàng)專利技術(shù)受到保護(hù)后,其它很多酶標(biāo)儀廠家在光柵型酶標(biāo)儀上面只能采用雙光柵系統(tǒng)來(lái)提高光純度,降低雜光率,即激發(fā)和發(fā)射各用了一組光柵,整個(gè)光路系統(tǒng)共四個(gè)光柵,所以也稱四光柵型酶標(biāo)儀,雖然也能提高其對(duì)雜光過濾,但是由于多了一組光柵作用后,其光強(qiáng)度損失較大,檢測(cè)的靈敏度也會(huì)受到影響。
 
優(yōu)化檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵技術(shù)之二,光源選擇,不同的單色器對(duì)光的透射率不同,會(huì)影響檢測(cè)靈敏度,那么光源本身強(qiáng)度高低也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的影響,目前酶標(biāo)儀比較普遍使用的光源分別為普通氙閃燈、高能氙閃燈和鹵素?zé)舻?。LED燈作為一種新光源以其自身許多優(yōu)勢(shì)慢慢被許多酶標(biāo)儀所采用,我們知道在同等效率下,LED燈壽命是傳統(tǒng)鹵素?zé)舻?0倍,免去了頻繁的更換燈泡和等待燈泡預(yù)熱所帶來(lái)的麻煩,其光源能量強(qiáng)、穩(wěn)定性好,所以有助于提高熒光檢測(cè)的靈敏度。
 
傳統(tǒng)酶標(biāo)儀是采用光路系統(tǒng)和檢測(cè)器系統(tǒng)一體式設(shè)計(jì)模式,模塊出廠就已經(jīng)固定,不可以進(jìn)行功能上的升級(jí)。市場(chǎng)上需要一種用戶可根據(jù)自己的要求進(jìn)行隨意升級(jí)的多功能酶標(biāo)儀,Molecular Devices針對(duì)市場(chǎng)需求推出了一款名為Paradigm多功能酶標(biāo)儀。它將光源系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)獨(dú)立分開,多套檢測(cè)器固定在主機(jī)上,針對(duì)不同實(shí)驗(yàn)要求選用不同的卡盒,每一種卡盒其實(shí)就是獨(dú)立的光路系統(tǒng),例如光吸收實(shí)驗(yàn)在波長(zhǎng)靈活性上要求較高,那么針對(duì)這樣的要求,光吸收卡盒采用光柵作為其單色器;針對(duì)于AlphaSreen 要求的特殊性,卡盒也采用了激光作為其光源,保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。
 
目前市場(chǎng)上唯一用戶自己可升級(jí)酶標(biāo)儀
用戶升級(jí)所用時(shí)間 < 2 minutes

Tune卡盒的推出被認(rèn)為是酶標(biāo)儀發(fā)展技術(shù)上又一次劃時(shí)代的突破,它是集熒光強(qiáng)度、化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨熒光三功能為一體的卡盒。首先它采用了高能AUTO-LED燈作為其光源,不但增加檢測(cè)靈敏度,而且還可以增加其檢測(cè)線性范圍,傳統(tǒng)酶標(biāo)儀針對(duì)不同強(qiáng)度的熒光信號(hào)采用在PMT(光電倍增管)進(jìn)行調(diào)節(jié),熒光強(qiáng)度檢測(cè)線性范圍一般在4至5個(gè)數(shù)量級(jí),采用了AUTO-LED燈可以使檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍增加至6至7個(gè)數(shù)量級(jí)。其次它將兩種不同單色器的優(yōu)勢(shì)整合為一體,采用了一種全新的濾光片可調(diào)式技術(shù),也就是既有光柵型單色器的靈活性(1nm光波可調(diào)),又保留了濾光片型單色器的光透率強(qiáng)的特點(diǎn)。這樣熒光強(qiáng)度和時(shí)間分辨熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)上,既增加其檢測(cè)的靈活性又增加檢測(cè)的靈敏度,有數(shù)據(jù)表明Tune卡盒在熒光檢測(cè)方面其靈敏度較光柵型單色器高10倍以上。
濾光片的靈敏度+光柵系統(tǒng)的波長(zhǎng)可調(diào) 完美結(jié)合!

Molecular Devices一直以客戶需求作為其研發(fā)重點(diǎn),Paradigm多功能酶標(biāo)儀和Tune多功能卡盒的推出就很好的證明了這一點(diǎn),針對(duì)未來(lái)不同實(shí)驗(yàn)的不同要求,Molecular Devices將會(huì)推出針對(duì)其新檢測(cè)方法的卡盒來(lái)更好的滿足用戶的需要。
 
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