隨著熒光檢測(cè)的普及，許多研究人員正考慮將western blot的檢測(cè)方法從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)到多重?zé)晒?。這一趨勢(shì)背后有多個(gè)推動(dòng)力。最重要的是，熒光檢測(cè)能夠?qū)崿F(xiàn)多重western blot分析，每次能夠同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)目標(biāo)蛋白，而不再需要?jiǎng)冸x和重新雜交。熒光的其他好處在于動(dòng)態(tài)范圍更寬、信號(hào)穩(wěn)定性更好。
熒光blotting的小貼士
• 抗體濃度應(yīng)當(dāng)優(yōu)化，在幾種不同稀釋度的抗體中孵育膜。選擇信噪比最高的稀釋度。
• 從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)到熒光檢測(cè)時(shí)，一抗?jié)舛葢?yīng)當(dāng)增加；通常來(lái)說(shuō)是增加2-5倍。二抗?jié)舛瓤赡芤残枰獌?yōu)化；1:5,000稀釋是個(gè)不錯(cuò)的起點(diǎn)。在使用特定抗體時(shí)，可以參照生產(chǎn)商的建議。
• 為了讓信噪比最高，應(yīng)使用自發(fā)熒光低的膜，如 Immun-Blot® low fluorescence (LF) PVDF membrane。
• 許多封閉液都成功用于熒光檢測(cè)。我們建議使用0.5-5% 酪蛋白、最多5%的脫脂奶粉，或最多3% BSA，溶于TTBS中。
• 緩沖液中的顆?？赡芡Ａ粼谀ど希⒃斐蔁晒饧傧?。只使用高質(zhì)量的試劑，并對(duì)所有緩沖液過(guò)濾滅菌。
• 使用鈍的鑷子從邊緣操作。避免劃破膜或弄皺，這會(huì)在熒光檢測(cè)時(shí)造成假象。
• 使用鉛筆來(lái)標(biāo)記膜，因?yàn)樵S多墨水都會(huì)發(fā)出熒光。
• 溴酚藍(lán)會(huì)發(fā)出熒光。確保染料與樣品已分開(kāi)，切掉凝膠上包含染料的部分，或省掉樣品緩沖液中的溴酚藍(lán)。
• 無(wú)需在暗處開(kāi)展免疫檢測(cè)；正常的室內(nèi)燈光不會(huì)使熒光標(biāo)記的抗體發(fā)生光漂白。不過(guò)，熒光標(biāo)記抗體的儲(chǔ)液應(yīng)保存在暗處。
• 在處理膜時(shí)，使用無(wú)粉末的手套，以避免膜上出現(xiàn)假象或指紋。
多重分析的小貼士
• 使用來(lái)自不同宿主的一抗（如小鼠和兔）。兩個(gè)親緣關(guān)系相近物種的抗體（如大鼠和小鼠）通常會(huì)造成交叉反應(yīng)，即使抗體已經(jīng)過(guò)交叉吸附。
• 使用經(jīng)過(guò)交叉吸附的二抗，以避免交叉反應(yīng)。
• 使用光譜上不同的熒光基團(tuán)偶聯(lián)物，避免交叉通道熒光。
• 在同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)之前，單獨(dú)優(yōu)化每個(gè)目標(biāo)的檢測(cè)。由于一些一抗并非很特異，在膜上會(huì)產(chǎn)生多條帶，故多重實(shí)驗(yàn)之前的單目標(biāo)檢測(cè)將有助于確定每個(gè)抗體的條帶模式。
• 大部分膜在波長(zhǎng)較短的激發(fā)光下會(huì)顯示出較高的背景。記住，在藍(lán)色通道檢測(cè)最強(qiáng)的目標(biāo)，在綠色通道檢測(cè)中等目標(biāo)，而保留紅色通道來(lái)檢測(cè)最弱的目標(biāo)。
