前言

       隨著人類對(duì)生物學(xué)領(lǐng)域深入探索和科技創(chuàng)新的不斷發(fā)展，目前越來越多的研究院所和生物制藥公司將細(xì)胞水平的功能性研究、模型建立及藥物篩選做為一個(gè)重要的研究/研發(fā)手段。而高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)就為這種細(xì)胞水平的研究提供了集高分辨率、自動(dòng)化、智能化及海量信息為一體的新的檢測(cè)平臺(tái)。干細(xì)胞（stem cells）是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體干細(xì)胞。正是干細(xì)胞的這種特性，為細(xì)胞生物學(xué)的研究提供了更有力的永生化的穩(wěn)定細(xì)胞株。干細(xì)胞水平的研究比在普通的細(xì)胞株提供了更接近臨床相關(guān)性的生理學(xué)信息；并且比原代細(xì)胞相比更容易獲得，且具有更好的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。

       干細(xì)胞的研究與其他細(xì)胞水平的研究有一些相似之處，但其關(guān)鍵的不同點(diǎn)在于在干細(xì)胞的研究過程中干細(xì)胞的分化。干細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)比傳統(tǒng)的單線性/單參數(shù)的實(shí)驗(yàn)具有更多的檢測(cè)目標(biāo)，包括其分化能力、分化過程、分化類型及不同類型的量化分析統(tǒng)計(jì)等。高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)以其自身的高分辨率、多參數(shù)及智能化分析的特性，恰如其分的滿足了干細(xì)胞研究的以上需求，而高內(nèi)涵成像系統(tǒng)的自動(dòng)化和高通量的特點(diǎn)又以海量的有效數(shù)據(jù)加速了該研究的過程。

       利用高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)可完成干細(xì)胞研究的自動(dòng)化圖像獲取及多參數(shù)分析，目前常用的全能性干細(xì)胞分化研究主要有三類：造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell, iPS）來源的心肌細(xì)胞（圖1）。

圖1：全能干細(xì)胞分化層次圖

應(yīng)用實(shí)例

1． 神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)球分化研究

冷藏保存的神經(jīng)祖細(xì)胞（StemCell Technologies, mouse Cells）培養(yǎng)在6孔板內(nèi)，在培養(yǎng)基中加入不同的生長(zhǎng)因子，培養(yǎng)6天后通過ImageXpress Micro對(duì)每孔內(nèi)神經(jīng)球進(jìn)行無標(biāo)記相差成像，并對(duì)的神經(jīng)球的面積進(jìn)行自動(dòng)化定量分析。結(jié)果如下（圖2）：

圖2：神經(jīng)球無標(biāo)記檢測(cè)及分析（ImageXpress Micro 20X 相差物鏡）

2． 神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞分化研究

神經(jīng)干細(xì)胞在加有EGF（表皮生長(zhǎng)因子）和bFGF（成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，然后在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-14天。加入EPO（促紅細(xì)胞生成素）后，檢測(cè)為神經(jīng)球向神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的分化情況。ImageXpress Micro進(jìn)行自動(dòng)化圖像獲取，運(yùn)用細(xì)胞分類（Cell Scoring）模塊進(jìn)行神經(jīng)元/膠質(zhì)細(xì)胞陽性率分析，運(yùn)用神經(jīng)生長(zhǎng)（Neurite Outgrowth）模塊進(jìn)行神經(jīng)元突觸長(zhǎng)度及數(shù)量分析。結(jié)果如下（圖3）：

圖3：神經(jīng)干細(xì)胞分化檢測(cè)及分析。圖（上）表示加入（左）及不加（右）神經(jīng)細(xì)胞的分化圖片；圖（下）表示不同條件下神經(jīng)元細(xì)胞的陽性率（左）及神經(jīng)元突出的長(zhǎng)度（右）。（ImageXpress Micro 20X物鏡）

3． 造血祖細(xì)胞向骨髓細(xì)胞及血細(xì)胞分化研究

人源CD34+造血祖細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，加入多種不同的造血細(xì)胞因子組合（SCF+Flk3+TPO/SCF+IL-3+GM-SCF）后，通過檢測(cè)CD45和CD15兩種標(biāo)記物在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)分析不同造血細(xì)胞因子組合對(duì)造血祖細(xì)胞的自我更新能力及骨髓細(xì)胞分化能力的變化。結(jié)果如下（圖4）：

圖4：檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CD45和CD15的陽性率，評(píng)價(jià)造血祖細(xì)胞在不同條件下的自我更新能力及定向分化能力

4． 誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell, iPS）向心肌細(xì)胞分化研究

iPS細(xì)胞（Celprogen）在專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-7天，同時(shí)檢測(cè)7種不同標(biāo)志物的表達(dá)量，以判斷心肌細(xì)胞分化及成熟的狀態(tài)。下圖（圖5）中顯示Oct4（干細(xì)胞標(biāo)記物）和a-Actinin（心肌細(xì)胞標(biāo)志物）在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況：

圖5：iPS細(xì)胞分化情況（ImageXpress Micro 20X 物鏡）

5． iPS細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞跳動(dòng)實(shí)驗(yàn)

臨床前安全性評(píng)價(jià)是藥物研發(fā)過程中非常重要的環(huán)節(jié)，早期的心臟毒理學(xué)研究將會(huì)大大降低在進(jìn)入臨床研究階段后因藥物毒性帶來的投入風(fēng)險(xiǎn)。iPS細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞跳動(dòng)實(shí)驗(yàn)為藥物心臟毒性評(píng)價(jià)提供了一個(gè)高效的體外細(xì)胞水平的檢測(cè)方法。心臟跳動(dòng)可通過傳統(tǒng)電生理的方法來檢測(cè)，用高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)來進(jìn)行檢測(cè)及分析是一個(gè)全新的挑戰(zhàn)。Molecular Devices公司最近一代的高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)ImageXpress Micro XL以其最新一代的檢測(cè)器sCMOS（采樣頻率可達(dá)100pfs）和自定義模塊分析功能，完全可出色完成心肌細(xì)胞跳動(dòng)實(shí)驗(yàn)的快速檢測(cè)及分析要求。

iPS細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞單層培養(yǎng)在96或384孔板中，心肌細(xì)胞會(huì)自發(fā)跳動(dòng)同步收縮。加入Calcein-AM染料孵育10min后，撤掉培養(yǎng)基，再加入不同濃度的化合物，置于ImageXpress Micro XL活細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，檢測(cè)心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率的變化。結(jié)果如下（圖6）：

圖6：iPS細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞跳動(dòng)實(shí)驗(yàn)（ImageXpress Micro XL 20X 物鏡）

總結(jié)

       干細(xì)胞研究作為一種復(fù)雜的細(xì)胞水平檢測(cè)模型，需對(duì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化能力、分化類型及狀態(tài)等多種參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)及定量分析，為疾病治療研究及藥物研發(fā)提供了更有效的研究手段。Molecular Devices公司的ImageXpress高內(nèi)涵系統(tǒng)提供了集高分辨率、自動(dòng)化、智能化及海量信息為一體高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)完全解決方案，可滿足以上研究需求（圖7）。

圖7：Molecular Devices公司針對(duì)干細(xì)胞研究的高內(nèi)涵成像系統(tǒng)完全解決方案