Kaori Taguchi、 Eiichiro Flukusaki 和 Takeshi Bamba
1 沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德市)
2 日本吹田市，大阪大學(xué)，生物技術(shù)系
目的
利用UltraPerformance Convergence Chromatography™ (UPC2™)超高效合相色譜建立一種可快速進行膽汁酸分析和定量的新方法。
背景
膽汁酸作為一種信號分子，在調(diào)節(jié)甘油三酯、膽固醇和葡萄糖代謝中扮演著重要的角色。 這些信號通路已經(jīng)成為開發(fā)治療代謝性疾病藥物的靶點。此外，膽汁酸還可用作血清中揭示肝臟疾病和膽汁酸調(diào)控代謝機制的生物標志物。因此，建立一種可測定體內(nèi)膽汁酸的分析方法具有重要意義。
由于結(jié)構(gòu)類似物(如同分異構(gòu)體)的存在，以及非結(jié)合型和結(jié)合型膽汁酸之間的極性差異使得膽汁酸的分離尤為復(fù)雜。過去，研究人員采用氣相色譜(GC)和液相色譜(LC)分析這些化合物，但這些方法都存在一定的局限性。GC法通常需要進行步驟繁瑣的衍生化處理，且衍生化的每個步驟中都會損失一定量的膽汁酸。此外，采用GC分析法測定結(jié)合型膽汁酸的成分或濃度時，需對若干等分的樣品分別進行提取。
采用超高效合相色譜串聯(lián)ESI-MS/MS系統(tǒng)，可在13 min內(nèi)同時分析25種膽汁酸。
圖1. 13 min內(nèi)同時分析25種膽汁酸標準品混合物，包括甘氨酸和?；撬峤Y(jié)合物。各MRM色譜圖中的化合物名稱按保留時間順序標示。
圖2. 采用UPC2/MS系統(tǒng)對大鼠血清中的膽汁酸進行定量測定(n=6)。
雖然LC分析法可同時檢測結(jié)合型和非結(jié)合型膽汁酸，但單針分析時間長達30min。在本應(yīng)用紀要中，我們將介紹一種可快速進行膽汁酸分析和定量的UPC2/MS方法。
解決方案
本實驗利用Waters® ACQUITY UPC2™系統(tǒng)，以超臨界二氧化碳(SCCO2)為主要流動相建立了一種可同時分離25種不同膽汁酸(包括其結(jié)合物在內(nèi))的方法。以SCCO2為流動相可加速分析物的擴散并降低反壓，從而縮短分析時間。為了提高分析的靈敏度和特異性，我們將ACQUITY UPC2系統(tǒng)與Xevo® TQ-S質(zhì)譜儀聯(lián)用。25種不同的膽汁酸(包括甘氨酸和牛磺酸結(jié)合物)的分離結(jié)果見圖1。
所有的膽汁酸在13 min內(nèi)實現(xiàn)分離，與此前的分析方法相比，分析時間縮短了約2倍。采用不同的固定相、柱溫設(shè)置、添加劑以及不同pH值的改性劑的組合對方法進行優(yōu)化。Xevo TQ-S的檢測模式設(shè)置為ESI負離子模式，無需使用尾吹氣即可獲得最大靈敏度。
使用這一方法對實際生物樣品(大鼠血清)中的膽汁酸及其結(jié)合物進行定量分析。使用甲醇按甲醇：血清3:1(v/v)的比例對購得的大鼠血清進行去蛋白處理，再進行渦旋和離心。取上清液注入UPC2/MS/MS，測定血清樣品中各膽汁酸及其結(jié)合物的濃度。結(jié)果如圖2所示，表明本方法可測定生物基質(zhì)中各膽汁酸及其結(jié)合物的水平，且重現(xiàn)性良好。
總結(jié)
采用超高效合相色譜(UPC2)串聯(lián)ESI-MS/MS系統(tǒng)，可同時分析生物基質(zhì)中的25種膽汁酸與其結(jié)合物。采用亞2μm填料的色譜柱，在13 min內(nèi)實現(xiàn)所有分析物的分離，分離度滿足要求。本應(yīng)用紀要證明：這一新的分離方法非常適合評價膽汁酸對甘油三酸酯、膽固醇和葡萄糖代謝的影響，并可促進治療代謝性疾病的新型藥物靶點的開發(fā)。
