免疫球蛋白(Immunoglobulin Ig)的含量代表著機(jī)體體液免疫的水平,并進(jìn)一步代表著B細(xì)胞的功能,因此測定血清Ig含量可以推知機(jī)體的體液免疫功能和診斷某些疾病引起的Ig的過高和過低。
隨著免疫學(xué)的發(fā)展和需要,免疫球蛋白的純化和其成分的提純成為必不可少的手段。純化的方法很多,有單一法,但大多數(shù)采用二步法以上相結(jié)合的方法,特別是以硫酸銨提純?yōu)榛A(chǔ),再經(jīng)過層析柱的方法來提高免疫球蛋白及其各成分的純度最為常用。
硫酸銨溶液能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷而使之沉淀下來(稱為鹽析)。不同濃度的硫酸銨鹽析蛋白成分不同,利用這一原理提取所需的免疫球蛋白成分。鹽析只能粗提,為了獲得純化的免疫球蛋白成分,必須進(jìn)一步采用層析的方法進(jìn)行分離。
免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。
一、IgG的分離與提純
1、材料與試劑配制
(1)動(dòng)物血清
(2)硫酸銨飽和溶液
硫酸銨800g~850g
H2O 1000ml
加熱至絕大部分溶質(zhì)溶解為止,趁熱過濾,置室溫過夜,然后以28%NH4OH調(diào)pH至7.0(不調(diào)pH值也可以)。
注:硫酸銨以質(zhì)量優(yōu)者為佳,因次品中含有少量重金屬對蛋白質(zhì)巰基有影響。如次品必須除去重金屬,可在溶液中通入H2S,靜置過夜后濾過,加熱蒸發(fā)H2S即可。
(3)0.01Mol/L pH7.4PBS液
A液:0.10Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4•;2H2O 15.60g
加H2O至1000.ml
B液:0.10Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4•;12H2O 35.80g
加H2O至1 000ml
取A液19ml,B液81ml加水至1000ml即可。
(4)1%BaCl2溶液
(5)納氏液
HgI 115.00g
KI 80.00g
加H2O至500.00ml
溶化后過濾,然后再加20%NaOH500.00ml,混合即可。
(6)0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。
(7)洗脫液:0.03Mol/L的NaCl液。
(8)透析袋(或玻璃紙)。
2、操作方法
(1)取20ml血清,加生理鹽水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4飽和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,邊加邊攪拌,充分混合后,靜置30min。
(2)3000r/min離心20min,棄去沉淀,以除去纖維蛋白。
(3)在上清液中再加(NH4)2SO4飽和溶液30ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,充分混合,靜置30min。
(4)3000r/min離心20min,棄上清。
(5)于沉淀中加20ml生理鹽水,使之溶解,再加(NH4)2SO4飽和溶液10ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,靜置30min。
(6)3000r/min離心20min,棄上清,以除去白蛋白。重復(fù)步驟5,2~3次。
(7)10ml生理鹽水溶解沉淀,裝入透析袋。
(8)除鹽,在常水中透析過夜,再在生理鹽水中于4℃透析24h,中間換液數(shù)次。
以1%BaCl2檢查透析液中的SO42-或以納氏試劑檢查NH4 (取3~4ml透析液,加試劑1~2滴,出現(xiàn)磚紅色即認(rèn)為有NH4 存在),直至無SO42-或NH4 出現(xiàn)為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。
(9)離心去沉淀(去除雜蛋白),上清液即為粗提IgG (即γ球蛋白,如以36%的飽和硫酸銨沉淀血清的產(chǎn)物即為優(yōu)球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。
(10)過DEAE-纖維素層析柱。(裝柱過程見層析技術(shù))。以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.03Mol/L NaCl)洗脫,收集洗脫液。
也可采用SephadexG150或G200柱。
也可采用SephadexG150或G200柱。
(11)蛋白質(zhì)及其定量鑒定。
(12)IgG的純度鑒定,可采用下列方法之一鑒定。
①玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可
加樣電泳后,只在γ—球蛋白的遷移部位出現(xiàn)一條帶。操作時(shí),同時(shí)可用全血清樣品,不同濃度(NH4)2SO4鹽析樣品進(jìn)行電泳,以資比較。
②瓊脂雙相雙擴(kuò)散鑒定
預(yù)先準(zhǔn)備該IgG免疫異種動(dòng)物所獲的抗IgG血清。將IgG與抗IgG血清進(jìn)行雙相雙擴(kuò)散,如IgG提純的話,則在兩樣品孔之間出現(xiàn)一條沉淀線。
③免疫電泳鑒定
孔內(nèi)加待測樣品,電泳后,在槽內(nèi)加抗IgG血清,瓊脂擴(kuò)散24h,觀察結(jié)果。如果提取的IgG純的話,則只出現(xiàn)一條弧形的沉淀線,且沉淀線位于γ—球蛋白區(qū)。此鑒定必須同時(shí)進(jìn)行全血清及抗血清抗體的免疫電泳,以資比較。
④圓盤電泳鑒定
用全血清樣品及提純樣品同時(shí)進(jìn)行圓盤電泳。全血清樣品在圓盤電泳上出現(xiàn)數(shù)十條區(qū)帶,而純化的IgG則只有一條區(qū)帶。
(13)IgG的濃縮與保存
①IgG的濃縮
②IgG的保存
一般濃縮至1%以上的濃度,再分裝成小瓶凍干保存,或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低溫冰箱保存,注意防止反復(fù)凍融。
3、IgG的簡易快速提取法
應(yīng)用硫酸銨鹽析及DEAE-纖維素層析法提純化的IgG,不僅操作復(fù)雜、需時(shí)較長,處理過程中樣品體積大大增加,而且透析時(shí)變性嚴(yán)重,容易引起抗體效價(jià)降低等。為了克服這一不足,特別是當(dāng)大量提取IgG時(shí),則往往采取下列的簡易辦法。
(1)DEAE-纖維素直接提取法
取樣品直接過DEAE-纖維素柱。下面介紹的是最為簡單的燒杯法。
①以一定數(shù)量的DEAE52放入燒杯中,加入0.01Mol/L pH8.0PBS緩沖液,靜置30min,去上清細(xì)粒,再重復(fù)一次。
②用布氏漏斗(內(nèi)放兩層濾紙)過濾。
③以5g濕重的DEAE-纖維素加1ml血清及3ml蒸餾水混合液的比例,加入各成分,充分?jǐn)嚢琛?/DIV>
④于4℃中放置1h,中間攪拌數(shù)次。
⑤用布氏漏斗抽濾,再用0.01Mol/L pH8.0PB緩沖液沖洗纖維素,抽濾。濾液即為提取的IgG液。
(2)DEAE-SephadexA-50為弱堿性陰離子交換劑,經(jīng)NaOH將Cl-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后,可吸附酸性蛋白,血清中除γ-G屬中性蛋白外其余均屬酸性蛋白。當(dāng)溶液的pH在6.5時(shí),酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附,只有γ-G留在溶液中。因此利用這一原理可以提取γ-G。這種提取法流程大大縮短,純化前后樣品體積變化不大,而且所得γ-G無變性現(xiàn)象。經(jīng)過四次處理,其純度也較好。缺點(diǎn)是收集量少,損耗大。
①DEAE—SephadexA—50的處理。取DEAE-SephadexA-50若干克,懸浮于蒸餾水中,1h后傾去上層小顆粒,然后用0.50Mol/L NaOH處理1h,蒸餾水洗至中性,再用0.5 Mol/L HCl處理0.5h,水洗至中性,最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。
②取一定的血清量,加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液,再加液體體積1/4的濾干的DEAE-SephadexA-50,混合、4℃放置1h,不時(shí)攪拌、抽濾、收集濾液。
③再用同樣重量的DEAE-SephadexA-50處理濾液。反復(fù)處理三次。(全程共四次)。獲得濾液即為γ-G制品。
④DEAE-SephadexA-50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脫,抽濾至濾液中無蛋白(OD280﹤0.04)后,再用蒸餾水洗至中性即可回收使用。
4、禽血清IgG的分離與提純(Na2SO4法)
(1)試劑
①5%葡聚糖硫酸鹽
②0.02Mol/L MnCl2溶液
③無水硫酸鈉
④pH8.2硼酸鹽緩沖液
⑤0.06Mol/L pH7.4PB液
(2)操作方法
①取禽血清10ml加5%葡聚糖硫酸鹽液,0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合,靜置,然后離心去沉淀,此步目的是為了去掉脂類物質(zhì)。
②于上清液中加無水硫酸鈉使每毫升血清含0.18g,緩慢加入,混勻,靜置30min,3 000r/min離心去上清。
③以pH8.2硼酸鹽緩沖液將沉淀稀釋至原血清的一半再加硫酸鈉使成0.16g/ml,同上法離心去上清。
④重復(fù)步驟③,加Na2SO4,使成0.14g/ml。
⑤以少量硼酸鹽緩沖液溶解沉淀,然后裝透析袋除鹽48h。
⑥過SephadexG200柱,收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM,第二峰主要是IgG。
⑦如要進(jìn)一步提純,則用第二峰再過DEAE—纖維素柱,以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脫,洗脫下來的蛋白液即為IgG。
也可以按以下操作方法進(jìn)行:
①以18%硫酸鈉(W/V)提取一次,再以14%的硫酸鈉提取一次。
②將粗提的免疫球蛋白以PBS溶解,按9%加入無水硫酸鈉,離心。再將上清按5%加入無水硫酸鈉,離心。將兩沉淀溶解、混合,在常水中透析過夜,再在生理鹽水中4℃透析,直至無SO4 2-為止。
③離心將上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。
④過SephadexG200柱,以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脫,收集洗脫液,取第二峰即為雞IgG。
二、IgM的分離與提純
1、材料
(1)血清
(2)葡聚糖凝膠G200
(3)洗脫液0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl或0.1Mol/L pH8.0 Tris-HCl 0.14Mol/L NaCl)
2、操作方法
選取2.50cm×90cm層析柱,用葡聚糖凝膠G200裝柱,平衡后,直接加血清樣品10ml或硫酸銨粗提制品,洗脫液洗脫,流速0.25ml/min,分管收集,測OD280值,第一峰即為IgM。將第一峰的數(shù)管混合,濃縮、鑒定。
三、IgA的分離與提純
1、材料與試劑配制
(1)DEAE52纖維素
(2)0.10Mol/L ZnSO4液
ZnSO4•;7H2O 2.88g
加水至1000.00ml
(3)飽和硫酸銨溶液
(4)10%EDTA—Na
(5)SephadexG200
(6)0.01Mol/L pH7.4PB液
(7)0.10Mol/L pH6.4PB液
(8)血清
2、操作方法
(1)取血清加等量的0.1Mol/L ZnSO4液,調(diào)pH至7.0,室溫?cái)嚢?h,離心去沉淀。
(2)于上清液中加入等量的飽和硫酸銨溶液,混勻后靜置30min或冰箱過夜。
(3)10000r/min離心10min,去上清。
(4)取沉淀溶于4ml10%EDTA-Na溶液中。
(5)生理鹽水中透析除鹽。
(6)過DE52柱,用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脫蛋白(IgG)棄去。
(7)換用0.1Mol/L pH6.4PB液洗脫,收集蛋白峰,即為IgA。
(8)再過SephadexG200柱,洗液為0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl),收集洗脫液測OD280值,取第一峰即為純化IgA。
(9)透析、濃縮、鑒定。
四、分泌型IgA的分離與鑒定
1、材料與試劑
(1)初乳
(2)SephadexG200
(3)0.10Mol/L pH6.8PB液
(4)0.01Mol/L pH7.4PB液
(5)DEAE52
2、操作方法
(1)取初乳20ml,10 000rpm離心10min,棄去表面脂肪層及底部的沉淀物。
(2)取乳清過SephadexG200柱(柱規(guī)格為2.50cm×90cm),以0.10Mol/L pH6.8PB液洗脫,第一峰為IgA(含IgG)。
(3)收集乳液,于0.01Mol/L pH7.4PB液中透析。
(4)將透析液濃縮至5mg/ml以上。
(5)過DE52層析柱,用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脫,洗下蛋白峰為IgG,棄去。
(6)換用0.10Mol/L pH6.8PB液或0.01Mol/L pH7.4PBS(0.10Mol/L NaCl)液洗脫,
收集洗脫液,即為較純的IgA液。
(7)必要時(shí),可再過一次SephadexG200柱。
(8)濃縮,鑒定
五、禽IgA提取與純化
1、材料與試劑配制
(1)禽膽汁
(2)飽和硫酸銨溶液
(3)0.01Mol/L pH7.4PBS液
(4)0.10Mol/L pH6.4PBS液(0.30Mol/L NaCl)
(5)DEAE52-纖維素
2、操作方法
(1)取冷藏的膽汁3Ⅹml,緩慢滴加Ⅹml飽和硫酸銨液,邊加邊攪拌,使成25%飽和硫酸銨液。4℃放置30min。
(2)3000r/min離心30min,去沉淀。
(3)取上清,加飽和硫酸銨液,使成35%的飽和度,4℃放置30min。
(4)3000r/min離心30min,棄上清。
(5)取沉淀,加0.85%NaCl液溶解,加飽和硫酸銨溶液,重復(fù)步驟3和4三次。
(6)將沉淀用0.85%NaCl液溶解,裝入透析袋,以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。
(7)以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡,過DEAE52纖維柱(20×250mm)。
(8)取透析樣品4ml(﹥20mg/ml蛋白濃度)加入層析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫。
(9)再用0.10Mol/L pH6.4PBS液(NaCl濃度為0.30Mol/L)洗脫,收集洗脫液。
(10)濃縮洗脫蛋白液至20mg/ml,分裝,低溫冰箱保存。
六、IgE的分離與提純
1、材料與試劑
(1)血清
(2)飽和硫酸銨溶液
(3)洗脫液0.005Mol/L pH7.4PB液
0.025 Mol/L pH7.4PB液
0.01Mol/L pH7.4PBS液(0.14mol/L NaCl)
(4)DE52
(5)SephadexG150
2、操作方法
(1)取血清倍比稀釋后,加等量飽和(NH4)2SO4溶液,鹽析。
(2)離心取沉淀,溶于少量生理鹽水中,透析、除鹽。
(3)過DE52柱,以0.005Mol/L pH7.4PB液洗脫,收集洗脫蛋白峰(IgG),棄去。
(4)換以0.025Mol/L pH7.4 PB液洗脫,洗下的蛋白峰主要是IgE。
(5)透析除鹽。
(6)過G150柱,以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl)洗脫,收集洗脫液即為純化的IgE。
(7)濃縮、鑒定。
標(biāo)簽:
蛋白質(zhì)
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