1.原理

等電聚焦凝膠電泳是依據(jù)蛋白質(zhì)分子的靜電荷或等電點進(jìn)行分離的技術(shù)，等電聚焦中，蛋白質(zhì)分子在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質(zhì)是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負(fù)極為堿性的連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點位置時，其靜電荷數(shù)為零，在電場中不再移動，據(jù)此將蛋白質(zhì)分離。

等電聚焦中，只有在凝膠兩端給以高電壓時，才能獲得較好的蛋白質(zhì)條帶分辨率，這就需要非常有效的凝膠冷卻系統(tǒng)（否則會導(dǎo)致燒膠），即凝膠同期周圍液體之間的熱傳遞效率要高。由于平板膠熱傳遞能力高，并可方便的同時比較多種蛋白質(zhì)樣品，所以平板膠用在等電聚焦上的居多。

由于等電聚焦對蛋白質(zhì)的電荷差異非常敏感，若要好的重復(fù)性，制備蛋白樣品時一定要小心，要避免任何對蛋白質(zhì)化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的修飾。另外，蛋白質(zhì)－脂類、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用可引起電荷改變，進(jìn)而導(dǎo)致等電點遷移或紋理現(xiàn)象。除非特殊需要研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用或者必須保持蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，等電聚焦通常在含有尿素的變性凝膠系統(tǒng)中進(jìn)行。使用非離子去垢劑也可以提高分辨率。

2.主要儀器、試劑

儀器：微型電泳系統(tǒng)、電源、注射器、固定和染色用容器
試劑：丙稀酰胺、雙－丙稀酰胺、載體兩性電解質(zhì)、尿素、過硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巰基乙醇、溴酚藍(lán)、磷酸、氫氧化鈉、氯化鉀、三氯乙酸、考馬斯亮藍(lán)、甲醇、乙酸。
儲存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）雙－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚藍(lán)；6）考馬斯亮藍(lán)染色液；7）考馬斯亮藍(lán)脫色液；

3.載體兩性電解質(zhì)的選擇

載體兩性電解質(zhì)是一些具有相近等電點的分子量為600－900Da的多氨基多羥基兩性化合物的混合物，下面時配置不同pH范圍等電聚焦凝膠的載體兩性電解質(zhì)的配方：

4.灌膠

以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6變性等電聚焦凝膠的配方。其他pH范圍等電聚焦可以參考表格來配置。

水：5.4ml； 儲存液1）：2.0 ml； 載體兩性電解質(zhì)溶液pH3.5-10 48μl； 載體兩性電解質(zhì)溶液pH4-6 240μl； 超純尿素 6.0 g ；10％過硫酸胺25μl； TEMED：20μl

灌膠步驟：1）組裝灌膠器；2）將尿素、水、溶液1）和載體兩性電解質(zhì)溶液混勻，避免劇烈搖動，輕微加熱尿素溶解更快（帶手套，丙稀酰胺有毒）；3）加入過硫酸胺和TEMED，輕輕混勻（開始聚合，操作要迅速）；4）將上述混勻溶液倒如灌膠器（盡量避免氣泡產(chǎn)生）；5）插入梳子，將梳子侵入膠內(nèi)（不要產(chǎn)生氣泡）；6）聚合約1小時；7）聚合完成，小心拔去梳子；8）將凝膠同冷卻裝置連接后插入電泳池，蛋白樣品上樣前最好用陽極電極液注入上槽中確定是否有滲漏。

注意：1）上樣前沖去上樣空底部未聚合的丙稀酰胺，否則電泳過程中會發(fā)生聚合；2）現(xiàn)在有商品化的等電聚焦凝膠，但只限于水平平板電泳系統(tǒng)（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.

樣品制備和上樣：
一般不同厚度的凝膠，不同的梳孔數(shù)目會有不同的上樣量，例如：0.75mm厚、15孔的凝膠每孔最大上樣量大約15μl。

變性凝膠上樣緩沖液2×Buffer（適用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10載體兩性電解質(zhì)：20μl；3）pH4-6載體兩性電解質(zhì)：100μl；4）20%Triton X－100：500μl：5）2－巰基乙醇：50μl；雙蒸水：1.7ml；1％溴酚藍(lán)：200μl

5.電泳

操作步驟：

1）將蛋白樣品于等體積的2×上樣緩沖液混合，10000×g離心5min以除去蛋白質(zhì)沉淀；2）用微量注射器將蛋白質(zhì)樣品加入到上樣空底部，注意不要溢出來。注意：對于考馬斯亮藍(lán)染色液來說，每個泳道10-30ug的蛋白混合粗提物（我們俗稱粗抗原）或者5-10ug單一蛋白組分是較合理的上樣濃度。

電泳液：

1）上槽中加入陰極電泳液（20mM氫氧化鈉：須由1M儲存液新鮮配置）；

2）下槽中加入陽極電泳液（10mM磷酸：須由1M儲存液新鮮配置）。

等電聚焦電泳條件：

1）接好電極；

2）恒壓150V電泳30min；

3）恒壓200V電泳2.5h，開始時候控制電流為10mA左右，在聚焦過程中電流有所下降，電泳內(nèi)室溫度在電泳的過程中將升至40－50攝氏度。

6．電泳聚焦后處理

測定pH梯度：

1）將凝膠條切成0.5cm或1cm的小片；

2）將每小片凝膠在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；

3）測讀此KCl溶液的pH值、

凝膠的固定：

1）將凝膠于10%三氯乙酸中浸泡10min；

2）換成1%三氯乙酸溶液繼續(xù)浸泡至少2h以上，以去除載體兩性電解質(zhì)，浸泡過夜可以更好的降低考馬斯亮藍(lán)對載體兩性電解質(zhì)的染色。

凝膠的染色：用考馬斯亮藍(lán)染色，然后脫色，制成干膠。

7.天然等電聚焦電泳的修正方案

如果要進(jìn)行天然等電聚焦電泳，要做一些修改；

1） 膠過程中配的凝膠中不需要加尿素；

2）上樣緩沖液（2×）5ml：其中1.8ml水，200μl載體兩性電解質(zhì)（同制膠成分），3ml甘油，上樣時候于等體積樣品混勻，10000×g離心5敏即可上樣；

3）室溫下電泳，接好電極，恒壓下先200V電泳1.5h，再400V電泳1.5h。

8.常見問題及解釋

1） 若產(chǎn)生模糊條帶則證明聚焦不完全，這可能是由于電泳中的問題或大分子蛋白質(zhì)限制了其在凝膠中的遷移能力。若聚焦時間過長或過短，條帶的分辨率會下降。增加電壓梯度可以使帶形更加銳利。高分子量蛋白質(zhì)在瓊脂糖凝膠中可以聚焦的更好。

2） 產(chǎn)生歪斜的條帶通常由于不正確的pH梯度，檢查電極是否潔凈，是否同凝膠鏈接良好，同時應(yīng)該注意凝膠的邊緣效應(yīng)。

3） 蛋白帶的紋理現(xiàn)象是等電聚焦中經(jīng)常遇到的問題，可能是一下原因：

a，蛋白質(zhì)聚集或沉淀（尤其在等電點附近），或上樣量過大，8M尿素通常用來防止蛋白質(zhì)聚集，去垢劑Triton X－100和NP－40常用來防止膜蛋白的聚集，所以上樣前一定要離心以除去不溶解的顆粒；

b，樣品中殘存核酸，可以采用多種方法去除核酸污染，如酸抽提、鹽沉淀、核酸酶消化等；

c，蛋白質(zhì)修飾，非超純級的尿素中的異氰酸鹽污染物可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨甲?；?，預(yù)電泳可以去除異氰酸鹽，蛋白質(zhì)樣品處理或儲存不當(dāng)會發(fā)生包括Cys殘基氧化，Asn或Gln殘基去氨基化等修飾過程；

d，波浪形條帶常由于樣品中鹽濃度過高，有時候載體兩性電解質(zhì)或電極液不純或電極不潔凈也會產(chǎn)生波浪形條帶；

e，電極同凝膠連接不平行，配置凝膠時候試劑不純，載體兩性電解質(zhì)濃度過低可導(dǎo)致不均等的pH梯度，若凝膠堿性部分pH梯度丟失，其可能原因是陽極飄移，可以補充pH9－11的載體兩性電解質(zhì)或進(jìn)行非平衡pH梯度電泳；

f，染色時候高背景的產(chǎn)生可能由于固定后載體兩性電解質(zhì)仍殘留于凝膠中，增加1％三氯乙酸的固定時間可解決；

g，蛋白質(zhì)條帶丟失或過淡可能由于蛋白質(zhì)分子量較低（<10kDa〉或蛋白質(zhì)在固定中未被變性，增加三氯乙酸濃度或使用戊二醛固定即可；

h，復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物等電聚焦后可以產(chǎn)生相互重疊的斑點，改變等電聚焦凝膠pH范圍可以解決此問題。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)純化或免疫沉淀處理可以避免重疊斑點的產(chǎn)生。

9．其他要注意的事項

1）等電聚焦后可用一根染色的細(xì)線（0.1mm）標(biāo)出染料前沿的位置；

2）不同品牌的載體兩性電解質(zhì)性質(zhì)上有細(xì)微的差別，使用不同來源的載體兩性電解質(zhì)凝膠時候蛋白質(zhì)分離樣式略有差異，若要獲得最好的重復(fù)性一般不要更換載體兩性電解質(zhì)的品牌；

3）通常，窄范圍的pH梯度可以提高分辨率，但是需要時間也比較常，pH梯度范圍為2是較好的選擇；

4）由于電源和凝膠冷卻系統(tǒng)的限制，最長的凝膠長度為8－10cm，實際上，分別電泳幾塊不同的pH梯度的凝膠比只電泳一塊較長凝膠效果更好；

5）當(dāng)?shù)入娋劢闺娪緯r間很長時候（>3000V·h），由于載體兩性電解質(zhì)不穩(wěn)定造成的陰極漂移將成為嚴(yán)重問題，陰極漂移會破壞pH梯度，尤其是pH8以上的梯度，為了克服此問題，開發(fā)了一種較短時間（1600V·h）完成等電聚焦電泳的技術(shù)，即非平衡pH梯度電泳，這樣可以在高pH范圍內(nèi)聚焦蛋白質(zhì)，但該方法不能用來測定蛋白質(zhì)等電點。

6）尿素可以促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解，并消除蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)－脂類相互作用，可增加聚焦速度和提高分辨率，同時抑制陰極漂移，但是也要注意變性蛋白質(zhì)的等電點可能同天然蛋白有所差異。

7）若蛋白溶液中含有SDS，可加入尿素至終濃度8M，在高濃度的尿素下，SDS同蛋白質(zhì)的相互作用極小。

8）在變性液中加入2%Triton X－100以保證蛋白質(zhì)（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推薦使用如CHAPS和Zwittergent3－14等兩性離子去垢劑；

9）超薄凝膠（50-500um）比常用標(biāo)準(zhǔn)等電聚焦更有優(yōu)勢，因為高電場強度和更佳的冷卻效果使聚焦速度更快，分辨率更高。

10）在聚丙烯酰胺等電聚焦凝膠中，高分子量蛋白質(zhì)（>750kd）常常表現(xiàn)異常的遷移行為，瓊脂糖凝膠或瓊脂糖－丙稀酰胺凝膠較適用于高分子量蛋白質(zhì)。

11） 考馬斯亮藍(lán)染色中，三氯乙酸固定后用0.25％SDS的乙醇：醋酸：水（33：10：57）溶液洗滌凝膠10-30min可以進(jìn)一步改善染色效果。SDS同載體兩性電解質(zhì)結(jié)合后可以更好的去除載體兩性電解質(zhì)。

10.固相pH梯度等電聚焦電泳

簡介：固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種等電聚焦技術(shù)，其所用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙稀酰胺衍生物，它們于丙稀酰胺和甲叉雙丙稀酰胺有相似的聚合行為。固定化電解質(zhì)一端的雙鍵可以在聚合中共價結(jié)合到聚丙烯酰胺介質(zhì)中，其另一端的R集團(tuán)為弱酸或弱堿，可在聚合物中形成弱酸或弱堿的緩沖體系，利用緩沖體系滴定終點附近一段pH范圍就可行成近似線性的pH梯度，所以固相pH梯度與載體兩性電解質(zhì)pH梯度的區(qū)別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時候便形成pH梯度，不隨環(huán)境電場條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點后才形成pH梯度。固相pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達(dá)到0.001pH，是目前分辨率最高的電泳方法之一。