利用T-wave離子淌度質(zhì)譜鑒定豬肌肉中的氟喹諾酮類抗生素的多位點分子離子及其碎片離子
Mike McCullagh1、Sara Stead¹、Jonathan Williams¹、Wouter de Keizer²和Aldert Bergwerff²

¹沃特世公司（英國曼徹斯特） ²RnAssays BV（荷蘭烏得勒支）

應用優(yōu)勢
利用T-wave離子淌度產(chǎn)生的正交分離有助于復雜基質(zhì)樣品的分析。
■正交淌度分離技術能采集并生成復雜樣品中各個組分的MS母離子和MSE子離子譜圖。
■對于觀察到的促進劑，可進行再次確認，并將其作為額外的鑒定點。
■使用HDMSE作為分析手段，可以對實驗室間或?qū)嶒炇覂?nèi)研究的差異性進行更深入的了解。

沃特世解決方案
ACQUITY UPLC®系統(tǒng)
SYNAPT®G2-S質(zhì)譜儀
MassLynx®軟件
DriftScope™ ACQUITY UPLC BEH色譜柱

簡介

氟喹諾酮是一類抗菌劑，可施用于牲畜，以達到多種目的，包括：(a)預防并控制感染；(b)促進生長。出于對抗性微生物在人類中傳播的顧慮，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）于2005年9月頒布了在牲畜生產(chǎn)中使用恩諾沙星和環(huán)丙沙星的禁令^1,2。2006年起，歐盟（EU）禁止在畜牧業(yè)中使用抗生素生長促進劑（AGP），同年，最后四種抗生素也被禁止作為生長促進劑³。

雖然氟喹諾酮是一類化學性質(zhì)多樣的兩性化合物，但這些化合物都具有4-喹諾酮環(huán)基本結(jié)構。為了增強其抗菌能力和藥代動力學特性，已進行了多種改性嘗試，包括在喹諾酮環(huán)（苯并吡喃酮核）四周引入不同的官能團。氟喹諾酮在其雙環(huán)結(jié)構的6位上帶有一個氟原子（圖1），表現(xiàn)出廣譜抗菌活性。目前，規(guī)定了八種（氟）-喹諾酮類化合物的歐盟最大殘留量（MRL），根據(jù)種類和組織類型的不同，限量范圍在10至1900 µg kg-1之間⁴。

實驗

提取準備
用于此次研究的豬肌肉組織提取物由RnAssays慷慨提供。簡單來講，在提取前根據(jù)相關的歐盟最大殘留量濃度要求，在已知的空白豬肌肉添加25種不同的抗菌化合物（來自于氟喹諾酮、四環(huán)素和酰胺醇類），將其在水/有機提取溶劑中，機械研磨成勻漿，然后進行離心操作。取上清液，并置于自動進樣器樣品瓶中進行后續(xù)的LC/MS分析。

UPLC條件
系統(tǒng)：  ACQUITY UPLC
色譜柱：  ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm， 50 × 2.1 mm
柱溫：  40 ℃
流速：  0.6 mL/min
流動相A：  水（0.1%甲酸）
流動相B：  乙腈（0.1%甲酸）
進樣體積：  10 μL

MS條件
質(zhì)譜儀：  SYNAPT G2-S
電離模式：  2.0 kV ESI+
錐孔電壓：  25 V
脫溶劑氣溫度：  550 ℃
參比質(zhì)量數(shù)：  亮氨酸腦啡肽，[M+H]⁺=556.2771
采集范圍：  50-1200 m/z
采集速率：  4光譜/秒
碰撞能量：  15-45 eV
分辨率：  20,000 FWHM 
IMS T-Wave速度：  550 m/s
IMS T-Wave脈沖高度：  40 V
緩沖氣體：  N₂和CO₂

氟喹諾酮殘留分析的典型步驟是：首先進行溶劑萃取，然后進行固相萃?。⊿PE）純化，并通過LC分離，結(jié)合UV檢測，熒光（FL）或質(zhì)譜（MS）檢測。這些方法通常只能檢測少量目標分析物，并且樣品通量較低⁵。許多不同種類的質(zhì)量分析儀常被用于獸藥殘留（VDR）分析，包括單四極桿、串聯(lián)四極桿、離子阱以及最近的基于飛行時間（Tof）的技術^6,7,8。串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀取代單級質(zhì)譜用于定量分析現(xiàn)已得到廣泛的接受，因為它在選擇性和靈敏度方面可提供卓越的性能優(yōu)勢。這得益于多重反應監(jiān)測（MRM）模式，在該模式下，首先使用第一個四極桿進行母離子的質(zhì)量數(shù)選擇，當選擇特定母離子的質(zhì)量數(shù)后，進入碰撞室碎裂，最后用第二個四極桿檢測。即便采用這種方法，其它與分析物無關的化合物仍有一小部分會產(chǎn)生干擾信號。出于這個原因，會對第二對MRM離子對進行監(jiān)測。只有樣品中，兩對離子對的MRM都產(chǎn)生了色譜峰并且色譜峰的保留時間與標準化合物的一致，才能確定該樣品存在該化合物。另外，這兩個MRM峰的強度比率也必須與純標準品的相同。此方法已經(jīng)在歐盟指令（2002/657/EEC）中進一步細化，該指令規(guī)定了對用于定量和確定食品和動物飼料中獸藥殘留的分析方法的要求⁹。

串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀廣泛用于需要在復雜基質(zhì)中，需要高靈敏檢測（通常濃度為較低的μg kg-1值）的殘留監(jiān)測項目。當選擇新的基于串聯(lián)四極桿的方法，以進行獸藥殘留分析時，對MRM通道的選擇十分關鍵，必須按照上文所述2002/657/EC指導原則進行選擇和驗證。

本應用紀要探索了使用High Definition Mass Spectrometry^TM（HDMS^TM）作為重要的方法開發(fā)工具，用于支持組織粗提取物中氟喹諾酮抗生素的明確鑒定。使用HDMS分析豬肌肉組織的粗提取物，以確定是否存在包括氟喹諾酮類在內(nèi)的抗生素殘留。該技術對于分析復雜基質(zhì)具有獨特的優(yōu)勢。它結(jié)合了高分辨率質(zhì)譜與基于離子淌度的高效分離方法。離子淌度光譜法（IMS）是一種快速的正交氣相分離技術，能在LC分離時間允許范圍內(nèi)，獲得另一個維度的分離。它是根據(jù)化合物的大小、形狀和電荷，對化合物進行區(qū)分的。另外，在HDMS實驗中，單次進樣就能獲得母離子及其碎片離子信息，稱為HDMS^E。

結(jié)果與討論
使用通用梯度條件，測得抗生素環(huán)丙沙星在保留時間2.19分鐘時洗脫，如圖3所示（圖3為基峰離子色譜圖）。

圖4所示為使用MassLynx軟件所得的常規(guī)精確質(zhì)量數(shù)譜圖，其中觀察到：在m/z為332.1410時，[M+H]+離子的精確質(zhì)量數(shù)測量誤差為0 ppm。通過獲得的精確質(zhì)量數(shù)測量結(jié)果與使用MassLynx中的元素組成計算工具，得到其元素組成，能使我們可靠地鑒定2.19分鐘的色譜峰。

圖3和圖4的常規(guī)數(shù)據(jù)說明所分析的氟喹諾酮為單一組分。然而，使用離子淌度分析發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮是由兩種離子化物質(zhì)組成，如圖5和圖6所示。盡管這兩個組分只是質(zhì)子化位點不同，但是，在使用離子淌度對環(huán)丙沙星的分析中，分離相差了1.14毫秒。淌度分離可使用圖5中的DriftScope查看，圖5為獸藥標準品混合物的漂移時間與保留時間變化圖。圖5顯示出分析的所有氟喹諾酮標準品的漂移時間分離以及獲得的離子強度。還突出顯示了環(huán)丙沙星的離子對強度。圖6顯示了這對離子的更多具體數(shù)據(jù)，其中突出顯示了相應的酸/堿基團質(zhì)子化位點和漂移時間¹⁰。

因此，每種促進劑都被視為單一組分，以獲得各自的碎片譜圖（圖7）。從單一組分MSE碎片譜圖中，可測定出環(huán)丙沙星酸性和堿性基團發(fā)生質(zhì)子化而產(chǎn)生的兩種淌度分離的物質(zhì)。實際上，m/z 314和m/z 231的碎片離子（圖7）是由酸性基團發(fā)生離子化的環(huán)丙沙星產(chǎn)生的。而m/z 288和m/z 245碎片離子只是由堿性基團質(zhì)子化的環(huán)丙沙星產(chǎn)生的。據(jù)觀察，兩種促進劑均能形成m/z 231碎片離子。有關碎片離子的進一步研究已經(jīng)完成，將在另一篇文章中進行介紹。

在圖4中，顯示了UPLC HDMS^E實驗生成的常規(guī)MS譜圖。在m/z 157和m/z 166處，清楚顯示環(huán)丙沙星存在兩個小的雙電荷離子，表明環(huán)丙沙星確實形成了一種雙電荷物質(zhì)。使用離子淌度能夠?qū)崿F(xiàn)分離并確認該小分子形成了雙電荷物質(zhì)。雙電荷物質(zhì)的形成與否，取決于使用的MS參數(shù)，尤其是錐孔電壓。如果錐孔電壓過高，則無法觀察到雙電荷物質(zhì)，僅能觀察到[M+H]⁺。

所得數(shù)據(jù)表明：應當仔細考慮方法開發(fā)和所選的分析方法，因為促進劑的比例和形成會根據(jù)洗脫液流速、毛細管電壓、錐孔電壓和基質(zhì)的不同而發(fā)生變化。如果選擇了MRM方法，則需要考慮使用的實驗條件和所選擇的具體質(zhì)譜通道。實驗數(shù)據(jù)表明：選擇的MRM離子對如果不一致，容易在實驗室內(nèi)和不同實驗室間產(chǎn)生偏差，闡述了保持這些化合物可重現(xiàn)性結(jié)果，遇到的挑戰(zhàn)。離子淌度是一種可用于方法開發(fā)的強大工具，能夠確保方法的可靠性并獲得一致結(jié)果。

除了更加具體和可靠的方法開發(fā)，不同組分的不同漂移時間，可作為另一個鑒別條件。本應用紀要介紹了可用作環(huán)丙沙星鑒定條件的保留時間、母離子精確質(zhì)量數(shù)、碎片離子精確質(zhì)量數(shù)和兩個漂移時間。

除了利用離子淌度獲得一個新的鑒定條件，還可將離子淌度產(chǎn)生的正交分離用于譜圖清理。漂移時間與保留時間變化圖（圖8A）顯示了離子強度，用白色像素表示?；|(zhì)離子的存在范圍用連續(xù)的白色表示。更大強度的分析物和基質(zhì)組分由更明顯的白點表示。但是由于基質(zhì)產(chǎn)生了大量的離子強度，所以很難觀察到低濃度的目標分析物。在圖8B中，從豬基質(zhì)中提取出了環(huán)丙沙星促進劑。根據(jù)使用離子淌度所得到的清晰、選擇性的分離，可產(chǎn)生單一組分的MS及其碎片離子譜圖。在這些條件下，豬基質(zhì)中的酸性位點促進劑與堿性位點促進劑的比例測定為5:1。這受到了毛細管電壓、錐孔電壓、電極位置、流速和基質(zhì)的影響。在注射實驗中，可以改變酸/堿促進劑的比例，甚至可改變含量最高的促進劑。

圖9和10顯示了環(huán)丙沙星、諾氟沙星和二氟沙星促進劑的到達時間分布以及分別使用氮氣和二氧化碳作為緩沖氣體時得到的峰間分離度計算結(jié)果。雖然兩種氣體都獲得了可接受的分離度，但是峰間的Rs值大于1.5才可視為完全分離。先前的研究認為：交替使用這兩種緩沖氣體，可增加離子淌度的分離度^10-14。

在執(zhí)行IMS時，離子分離在T Wave離子淌度（TWIM）漂移管中進行，分離結(jié)果由電荷態(tài)、質(zhì)量數(shù)、形狀、緩沖氣體極化率以及離子與中性氣體分子間的相互作用決定。在該應用中，增加緩沖氣體的極化率，能增加TWIM的分離能力（峰容量）。因此，通過充分考慮所使用的緩沖氣體的極化率，可使峰與峰之間的分離度得到提高，在本研究中，使用的是二氧化碳。使用氮氣或二氧化碳時獲得的峰間分離度（Rs=1.18(ta-tb)/W0.5,a+W0.5,b）匯總于表1中（其中Rs表示計算得到的分離度，W0.5a和W0.5b分別表示峰A和峰B的半高峰寬，ta和tb分別為峰A和峰B的漂移時間）?？梢钥吹剑斒褂枚趸甲鳛殡x子淌度緩沖氣體時，所有氟喹諾酮促進劑對均完全分離，峰間分離度介于2.61和4.13之間。使用二氧化碳所增加的峰容量進一步提升了單一組分母離子及其相應的單一組分碎片離子譜圖的質(zhì)量。

結(jié)論
基于對本研究中氟喹諾酮化合物的特征離子化的觀察，使用UPLC IMS MS^E進行方法開發(fā)是合理的。
  ■ 使用離子淌度，可將同一分子，不同質(zhì)子化物質(zhì)實現(xiàn)神奇的分離。
  ■ 顯示并鑒別了同分子，不同位點質(zhì)子化合物的碎片譜圖。
  ■ 得到每個組分的母離子MS及其MS^E碎片譜圖
  ■ HDMS^E觀察結(jié)果可以解釋在同一實驗室內(nèi)監(jiān)測特定MRM離子隊獲得的研究對象報告結(jié)果有時 會出現(xiàn)差異的原因。
  ■ 漂移時間值可作為保留時間、母離子精確質(zhì)量數(shù)和碎片精確質(zhì)量數(shù)譜圖之外的又一個鑒定條件。
  ■ 離子淌度分離可以有效地將目標峰從基質(zhì)干擾中分離出來，而不需要對復雜樣品進行純化及色譜分離。

參考文獻
1.  Final Decision of the Commissioner, Docket # 2000N-I 57 1 October 24,  2000, Withdrawal of the approval of the new animal drug application for  enrofloxacin in poultry. Department of Health and Human Services, U.S. Food  and Drug Administration.
2.  FDA Center for Veterinary Medicine, June 2, 1997, FDA Order Prohibits  Extralabel Use Of Fluoroquinolones And Glycopeptides.
3.  Official Journal of the European Union, L268:29-43, Regulation (EC) No  1831/2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September  2003 on additives for use in animal nutrition.
4.  Official Journal of the European Union, L24:1-8 Annex I, Council Regulation  (EEC) No 2377/90 of 26 June 1990 laying down a Community procedure  for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal  products in foodstuffs of animal origin.
5.  Verdon E, Couedor P, Roudaut B, Sandérs PJ. Multiresidue Method for  Simultaneous Determination of Ten Quinolone Antibacterial Residues in  Multimatrix/Multispecies Animal Tissues by Liquid Chromatography with  Fluorescence Detection: Single Laboratory Validation Study. AOAC Inter.  2005; 88:1179-1192.
6.  Kaufmann A, Butcher P, Maden K, Widmer M, Giles K, Uria D. Are liquid  chromatography/electrospray tandem quadrupole fragmentation ratios  unequivocal confirmation criteria? Rapid Commun. Mass Spectrom. 2009;   23: 985-998.
7.  Mol HG, Zomer P, de Koning M. Qualitative aspects and validation of a  screening method for pesticides in vegetables and fruits based on liquid  chromatography coupled to full scan high resolution (Orbitrap) mass  spectrometry. Anal Bioanal Chem. 2012; 403:2891-2908.
8.  Croley TR, White KD, Callahan JH, Musser SM. T he chromatographic role   in high resolution mass spectrometry for non-targeted analysis.   J Am Soc Mass Spectrom. 2012; 23:1569.
9.  Commission Decision (2002/657EEC) Official Journal of the European  Communities 2002. 10.  Lalli PM, Iglesias BA, Toma HE, de Sá GF, Daroda RJ, Silva Filho JC,  Szulejko JE, Araki K, Eberlin MN. Protomers: formation, separation and  characterization via travelling wave ion mobility mass spectrometry. J Mass  Spectrom. 2012; 47(6):712-9. 11.  Eberlin MN, Lali PM, Nachtigall FM, Riccio MF, de Sa GF, Daroda RJ, de  Souza V, Campuzano I, Souza GHMF. SYNAPT HDMS: Improving Ion Mobility  Separation by Increasing Drift-Gas Polarizability. Waters Technical Note  720003201en. 2009 October. 12.  Jurneczko E, Kalapothakis J, Campuzano IDG, Morris M, Barran PE. Effects   of drift gas on collision cross sections of a protein standard in linear drift   tube and traveling wave ion mobility mass spectrometry. Anal Chem.   2012; 84(20):8524-31. 13.Asbury GR, Hill HH. Using different drift gases to change separation factors  (alpha) in ion mobility spectrometry. Anal. Chem. 2000; 72(3): 580-4. 14.  Fasciotti M, Sanvido GB, Santos VG, Lalli PM, McCullagh M, de Sá GF,   Daroda RJ, Petera MG, Eberlina MN. J Mass Spectrom. 2012; 47(12):1643-7.