摘要:熊果酸高含量為有光澤的棱柱狀(無水乙醇)或細(xì)毛樣針狀結(jié)晶(稀乙醇),低含量為棕黃色或黃綠色粉末,具特殊的氣味,是存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物。
目的為控制樂山梔子的質(zhì)量,建立高效液相色譜法測(cè)定樂山梔子中熊果酸含量的方法。方法采用高效液相色譜法,以熊果酸為化學(xué)對(duì)照品,固定相:UltimateTMC18鍵合硅膠柱(4.6mm×250mm,5μm),流動(dòng)相:甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺(90∶10∶0.03∶0.06),流速0.6ml·min-1,溫度25℃,波長210nm測(cè)定樂山梔子熊果酸含量。結(jié)果熊果酸在0.1~3.0μg范圍內(nèi)峰面積A與其質(zhì)量M呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,其回歸方程為:A=-12954.8829+452850.9603M,r=0.9996,n=7;3批樂山梔子中熊果酸的含量分別為(0.2555±0.0016)mg·g-1藥材,RSD=0.6221%,n=4;(0.265825±0.003491)mg·g-1藥材,RSD=1.313%,n=4;(0.258875±0.006198)mg·g-1藥材,RSD=2.394%,n=4;精密度實(shí)驗(yàn)RSD=1.754%,儀器精密度良好;穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD=3.493%,在3.5h測(cè)定熊果酸的含量是穩(wěn)定的;重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)RSD=0.9051%,平均回收率101.9%。結(jié)論高效液相色譜法適合樂山梔子中熊果酸的含量測(cè)定,該方法操作簡便,結(jié)果穩(wěn)定,精密度、重現(xiàn)性、回收率較好,值得推廣。
梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí),主產(chǎn)于浙江、四川、江西、重慶、湖北等省。梔子具有瀉火除煩、清熱、涼血解毒之功效,用于熱病心煩、黃疸、尿赤、血淋澀痛、血熱吐衄、目赤腫痛、火毒瘡癰等證。根據(jù)現(xiàn)代藥理研究證實(shí),熊果酸為梔子重要有效成分,具有顯著而迅速降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶,消退黃疸,增進(jìn)食欲和恢復(fù)肝功能的作用,這在茵梔黃注射液、茵陳蒿湯等方劑中得到廣泛的應(yīng)用。梔子治療急性黃疸型肝炎、病毒性肝炎主要是通過其有效成分熊果酸實(shí)現(xiàn)的,熊果酸是梔子利膽退黃、抗病毒性肝炎的主要有效成分。梔子熊果酸還具有解熱降溫、抗炎、抗腫瘤等活性。有報(bào)道表明,梔子苷的生理活性有限,其利膽作用、保護(hù)肝損傷、降低轉(zhuǎn)氨酶方面均不及梔子中熊果酸明顯,而且梔子苷分子中雙鍵性質(zhì)活潑,不穩(wěn)定,易發(fā)生反應(yīng)。相比而言,梔子熊果酸受熱更穩(wěn)定,因此控制梔子熊果酸含量具有非常重要的質(zhì)量評(píng)價(jià)意義[1~6]。本研究通過高效液相色譜法測(cè)定樂山梔子熊果酸含量,為建立樂山梔子質(zhì)量新標(biāo)準(zhǔn)提供參考。
1儀器與材料SSI高效液相色譜儀;UltimateTMC18鍵合硅膠柱(4.6mm×250mm,5μm);AS3120AUltrasonicCleaner;AP-01P真空泵;HaierBCD-176DA電冰箱;SHHV21型長風(fēng)三用電熱恒溫水浴箱;ZK072型電熱真空干燥箱;RE-52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;AS701KDTUltrasonicCleaner;UV-9200型紫外可見光分光光度計(jì);FA1104W電子天平;Sh10A型水份快速測(cè)定儀;50目分樣篩;KodakEasyshareZ7590數(shù)位相機(jī);CASIOfx-4800p電子計(jì)算器;冰醋酸、甲醇、三乙胺為分析純,色譜純甲醇;熊果酸化學(xué)對(duì)照品(110742-200516,約20mg,供含量測(cè)定用)(中國藥品生物制品檢定所)、梔子產(chǎn)自四川樂山(經(jīng)課題組鑒定為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí))。
2方法與結(jié)果2.1色譜條件固定相:UltimateTMC18鍵合硅膠柱(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相為甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺(90∶10∶0.03∶0.06);流速0.6ml·min-1;溫度25℃;波長210nm[7]。
2.2梔子熊果酸提取條件優(yōu)選以藥材粒徑、甲醇加入量、超聲提取時(shí)間、超聲提取次數(shù)4因素3水平,以熊果酸收率為指標(biāo),選用L9(34)正交表優(yōu)選梔子熊果酸提取條件為:梔子藥材粉碎為50目粉末,加入甲醇量為藥材量的5倍,每次超聲提取60min,超聲提取3次,可使熊果酸收得率達(dá)到最大,且經(jīng)濟(jì)合理,將另文報(bào)道。
2.3熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[8]精密稱取熊果酸化學(xué)對(duì)照品2.0mg(60℃減壓干燥24h),用無水甲醇定容于10ml容量瓶中,即得0.2mg·ml-1的熊果酸對(duì)照品溶液。熊果酸在0.1~3.0μg范圍內(nèi)峰面積A與其質(zhì)量M呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,其回歸方程為:A=-12954.8829+452850.9603M,r=0.9996,n=7。
2.4精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取上述熊果酸對(duì)照品溶液10μl,其積分面積RSD=1.754%,n=5,表明該方法、該儀器測(cè)定熊果酸精密度符合要求。
2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取上述熊果酸對(duì)照品溶液10μl,每隔30min測(cè)定1次,其積分面積RSD=3.493%,n=5。表明熊果酸用該方法在該儀器上3.5h內(nèi)測(cè)定結(jié)果較穩(wěn)定,符合要求。
2.6梔子熊果酸含量測(cè)定重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)照前面“2.2”項(xiàng)梔子熊果酸的提取工藝,測(cè)得梔子熊果酸含量RSD=0.9051%,表明該方法重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)符合要求。
2.7梔子熊果酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)照前面“2.2”項(xiàng)梔子熊果酸的提取工藝提取,取該溶液2ml,加入上述熊果酸對(duì)照品溶液0.3ml,平均加樣回收率為101.9%,表明該方法測(cè)定梔子熊果酸的加樣回收率符合要求。
2.83批樂山梔子熊果酸含量測(cè)定按照“2.2”項(xiàng)的提取條件提取3批樂山梔子熊果酸,按照上述測(cè)定條件分別測(cè)定熊果酸含量,測(cè)定結(jié)果見表1[9]。
3討論經(jīng)過采集樂山、云南、貴州、湖南、河南等地的梔子并測(cè)定熊果酸含量,發(fā)現(xiàn)樂山梔子含量最高,證實(shí)其確為質(zhì)量優(yōu)良的正宗川梔子。
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),上述熊果酸對(duì)照品溶液積分面積為1.5×105~2.5×105,峰高為6×103~7×103,理論塔板數(shù)約1.2×104時(shí),峰高法計(jì)算結(jié)果與真實(shí)值的誤差為1.240%,積分面積計(jì)算結(jié)果與真實(shí)值的誤差為1.415%,表明峰高法比積分面積法更接近真實(shí)值,尤其適用于熊果酸峰與齊墩果酸及其衍生物峰未完全分開時(shí)??紤]到樂山梔子中熊果酸峰與齊墩果酸及其衍生物峰完全分開,而且峰高法計(jì)算結(jié)果與峰面積法計(jì)算結(jié)果無顯著性差異,出于習(xí)慣考慮,本文仍采用峰面積法測(cè)定樂山梔子熊果酸的含量。表1樂山梔子熊果酸含量(略)
冰醋酸主要用于改善熊果酸與齊墩果酸及其衍生物圖譜分離度,由于冰醋酸具有揮發(fā)性,對(duì)熊果酸與齊墩果酸及其衍生物圖譜分離度存在一定程度的波動(dòng),通過反復(fù)實(shí)驗(yàn),才得到較成功的圖譜。若改用不具有揮發(fā)性的磷酸,則能改善熊果酸與齊墩果酸及其衍生物圖譜分離度的波動(dòng)性,可能更容易成功,有待于進(jìn)一步研究。
熊果酸提取溫度最好在60℃以下,樣品溶液置于0℃冰箱中貯存,測(cè)定時(shí)分析室的溫度控制在25℃左右,以避免熊果酸分解對(duì)結(jié)果造成影響。