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生物制藥開發(fā)早期的粘度測量新方法概述

   2024-12-23 現代實驗室裝備網851
對于研究人員在制藥,特別是生物制藥的預配方開發(fā)階段所面臨的諸多分析難題中,粘度的測量尤其重要。能夠在生物制劑研制的早期準確確定粘度,對于后續(xù)研制階段中降低失敗候選樣品數量起到關鍵的作用。對于樣品量極少的貴重樣品,依據配方條件(通常是濃度很高的情況下)進行測量時,測量的難度尤其巨大。
 
常規(guī)的粘度測方法在上述情況下往往不能進行。除了樣品量很少外,人們越來越多地需要在同一只小樣本上進行高通量多參數的自動化測量。本文介紹了紫外區(qū)域成像技術在生物制劑粘度和分子大小的自動測量方面的應用及其相比于傳統(tǒng)技術所具備的優(yōu)勢。
 
開發(fā)可注射的生物療法
 
在生物療法的開發(fā)中,藥物的療效和患者的體驗是十分關鍵的因素。由于大多數生物分子都無法經受胃腸道路線的嚴酷環(huán)境,通常會采用靜脈注射、肌肉注射或皮下注射的給藥方法?;钚苑肿拥臐舛缺仨毾鄬^高,通常超過100 mg/mL,以補償其較短的血漿半衰期。最大的難題之一是,如何開發(fā)可以低劑量注射的高濃度配方,以達到最大的有效性,并提高患者舒適度。因為在生物制藥中,高濃度往往意味著高粘度以及腸外給藥帶來的潛在問題。
 
生物制劑配方是一個極具吸引力的領域,而對這個領域的認識以及可以支持其發(fā)展的分析工具體系的發(fā)展也十分迅速。然而,這其中有一個測量方面的難題直到現在才完全得到解決,即怎樣在開發(fā)的早期階段對低粘度特性或不符合規(guī)定粘度范圍的配方進行篩選。包括旋轉流變儀和標準毛細管粘度計在內的傳統(tǒng)粘度測量技術不太適合生物制藥早期開發(fā)的需求,其原因是必須用極少量的珍貴樣品進行多種測試,而這類測試對微量分析、高通量和樣品回收的要求都非常高?,F在有一種新的方案可以解決上述這個測量難題,它是將紫外區(qū)域成像與微毛細管粘度計相結合,為生物制藥配方提供快速、高通量和非破壞性的粘度和分子大小測量。在開發(fā)過程的較早期階段對粘度進行可靠測量,開啟了挑選具有更好可注射性候選生物治療制劑的可能性。
 
用紫外區(qū)域成像方法用于粘度和尺寸測量
 
在這一應用中,紫外區(qū)域成像被用于監(jiān)測紫外活性樣品通過微毛細管過程中吸光率隨時間變化的情況,這些樣品包括蛋白質、多肽和其它含紫外發(fā)色團的分子等。長期以來,毛細管粘度計的檢測方法是通過簡單測定藥物從端口到檢測器的時間來確定樣品粘度,但由于一直受進樣時間誤差的影響,容易導致隨后的計算中出現重大錯誤。新的系統(tǒng)采用雙通道毛細管設計,樣品通過毛細管分先后兩次流經紫外檢測窗,從而可以準確檢測樣品兩次經過窗口的時間,進而準確測得樣品的粘度。對樣品粘度和尺寸的分析都是基于兩個窗口之間的時間變化而得出的。
 
在已知恒溫恒壓下,樣品的粘度可以參比已知粘度的樣品,通過檢測樣品兩次經過UV 檢測窗口之間的時間得到。樣品檢測可以通過使用UV 成像陣列,按照具體樣品的吸收率范圍,對樣品進行一系列的單獨快照來實現。用信號處理算法測定樣品的粘度,并選取適當的時間位移,對前述快照的平均狀態(tài)進行綜合計算,再轉換成精確的粘度、分子大小和濃度測量值。
 
測定依賴于特定分子的獨特紫外吸收而不是其物理特性。這個特點使其能對極低的樣品量進行測量——對粘度測量而言,樣品體積小于10 微升;而對尺寸測量,樣品體積則小于10 納升。由于紫外分析技術對于樣品沒有傷害,因而可以對分析過的樣品進行回收。與之相對,傳統(tǒng)的流變技術雖然能測量蛋白質樣品粘度,但同時對樣品剪切變??;在樣品與空氣接觸的界面,剪切、蛋白吸附和變質的影響更加嚴重。
 
圖2 對旋轉流變儀與基于紫外區(qū)成像的粘度計進行了比較,結果表明兩種技術在對樣品的影響方面存在著明顯差異。微毛細管分析技術觀察不到剪切變稀現象,這表明在旋轉流變測量中所發(fā)生的剪切變稀可能是由于空氣-樣本接觸界面的松散結構所造成的。
 
紫外線區(qū)域成像系統(tǒng)中,全封閉的微毛細管中不存在樣品和空氣的接觸問題,可防止樣品在分析過程中受到損壞或污染,從而可以實現樣品的再利用。結合高通量分析的能力,紫外線區(qū)域成像特更加適用于生物治療的早期篩查。
 
分析類型的靈活性
 
紫外區(qū)域成像的吸引力之一是其具備多種測量的能力。除了單純的粘度分析,該方法也可以用于對分子大小和樣品濃度進行分析。
 
由于被較大的分子遮蓋,對位于復雜體系中的小分子大小進行表征描述的難度非常高。因此,傳統(tǒng)的尺寸測量方法要求使用高濃度的樣品,以確保分析的有效性。用紫外區(qū)域成像進行尺寸分析可不受分子大小的限制,為上述問題提供了潛在的解決方案。由于不同的樣本具有各自不同的UV吸收波長(假設分子的紫外吸收度可以檢測得到),就可以特定的檢測出目標分子的信號反應。
 
尺寸的計算與粘度測量的方式類似。隨著樣品沿毛細管流動,粒子或分子的擴散引起峰值的擴展,但這種擴展會因橫向擴散而削弱。存在的分子越小,橫向擴散就越迅速,峰值區(qū)就越窄。當存在較大的分子時,會使橫向擴散減慢,從而使峰值區(qū)變寬。
 
如圖3 所示,可利用兩個窗口之間峰值區(qū)寬度的變化,計算出我們感興趣的分子流體動力學半徑。最后,紫外區(qū)域成像還可用作特定活性成分濃度的檢測方法。Beer-Lambert 定律將UV 吸收與發(fā)色團濃度直接聯系起來,從而有可能確定存在于溶液中的某種特定物質的數量及尺寸。綜上所述,UV 區(qū)域檢測儀的應用實現了三種測量功能,即整體溶液的粘度、所含分子尺寸及其濃度的測量。
 
應用示例 - 賦形劑對蛋白配方粘度的影響
 
高濃度、低粘度配方開發(fā)是目前的重點研究領域,而實現這一目標的一個重要策略是在配方中加入能降低粘度的賦形劑。
 
添加小分子賦形劑,如精氨酸、二甲亞砜和疏水鹽,可以抑制聚合網絡的形成,減少高濃度蛋白質溶液的粘度。
 
近期的一項研究闡述了基于紫外線區(qū)域成像的微毛細管粘度計如何識別不同蛋白質賦形劑配方之間的粘度差別,并展示了在一定的粘度范圍內 [1] 對適當的候選配方進行篩選時,如何將運用這一技術。下面列出的數據由商業(yè)化的紫外區(qū)域成像系統(tǒng)(馬爾文儀器公司,Viscosizer 200)得到。
 
在兩種不同賦形劑緩沖溶液中含有濃度為400 mg/mL 的牛血清白蛋白 (BSA) 蛋白質原液:兩者均含30mM 組氨酸,pH 值為5.3,但其中一種緩沖溶液中還含有200mM 精氨酸。再用這些原液制備一系列稀釋液,并用標準紫外光譜法對每種溶液的濃度進行測定。在20℃下,按100 μL/份分裝到玻璃小瓶中,并放置到儀器的自動進樣器旋轉盤上。
 
在214nm 的波長下,在兩個檢測窗口間對上述樣品的變化情況進行監(jiān)測。然后將得到的粘度結果記錄下來,對彼此作圖,并對預先確定的粘度范圍進行作圖,如圖4 所示。
 
圖4 列出了絕對粘度隨BSA 濃度變化的曲線。正如預期,配方的絕對粘度隨著濃度的增加而增加。當濃度低于250 mg/mL 時,兩種緩沖溶液之間沒有明顯的差異。但當濃度高于250 mg/mL 時,未添加精氨酸的30mM 組氨酸緩沖液中的BSA 配方溶液粘度高于那些含精氨酸的配方。有證據證明精氨酸能夠降低蛋白質粘度,特別是在單克隆抗體的研究 [2, 3, 4] 中。
 
結論
 
生產高濃度、低粘度的生物治療制劑是當今醫(yī)藥行業(yè)所面臨的主要挑戰(zhàn)之一。本文所介紹的這種新技術將紫外區(qū)域成像與微毛細管粘度計相結合,提供了有效的高通量技術,可在配方濃度下對極少量的未改性樣品進行非破壞性分析,從而為生物制藥開發(fā)提供有力支持。這就使制藥廠商得以在藥物開發(fā)早期階段篩選候選藥物時就能確定其粘度曲線,及早發(fā)現后期生產中可能遇到的任何問題提。能夠及早判斷是否有必要繼續(xù)(或是終止)對于候選分子進行下一步篩選,將獲得很高的經濟效益。
 
參考文獻
[1] 《賦形劑對蛋白配方粘度的影響——通過Viscosizer 200 對微量樣品粘度計的研究:馬爾文儀
器公司應用報告》(2013 年8 月19 日)點擊下載
[2] T.J. Kamerzell,A.L. Pace,M. Li,D.M. Danilenko,M. McDowell,Y.R. Gokarn,Y.J. Wang 著:《極性溶劑通過疏水溶質和相互作用降低高濃度IgG1 配方溶液的粘度:配方及生物相容性影響》2013 年,J Pharm Sci,102(4)1182-93
[3] Z. Guo,A. Chen,R.A. Nassar,B. Helk,C. Mueller,Y. Tang,K. Gupta,A.M. Klibanov 著:《疏水鹽作為單克隆抗體濃溶液降粘度賦形劑的結構-活性關系》,Pharm Res,2012 年,29(11):3102-9
[4] J. Liu,M.D.H. Nguyen,J.D. Andya,S.J. Shire 著:《可逆自締合提高水溶液中高濃度單克隆抗體粘度》,J Pharm Sci,2005 年,94(5):1928-40
 
圖1:使用紫外區(qū)域成像進行樣品分析的原理圖。檢測樣品通過毛細管兩次流經紫外窗口時的時間區(qū)間,而不是檢測樣品從進樣到檢測器的時間。
 
圖2:使用旋轉流變儀(馬爾文儀器公司,Kinexus)以及帶紫外區(qū)域成像的微毛細管粘度計(馬爾文儀器公司,Viscosizer 200)檢測自然生成的卵清蛋白剪切變稀現象。
 
圖3:兩個窗口之間樣品峰形狀的變化,用于分析待測樣品中分子的流體動力學半徑。較小的分子產生的峰形較高而較窄,而較大分子產生的峰形較短而較寬。
 
圖4:含BSA 配方的賦形劑絕對粘度隨濃度變化的曲線。圖中顯示有四種配方的粘度超過臨界20cP。
 
作者:Lisa Newey-Keane 博士,馬爾文儀器公司生物制藥產品經理
 
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