隨著生物分子在許多制藥公司藥物開(kāi)發(fā)途徑中所占據(jù)的比例越來(lái)越大，人們?cè)絹?lái)越關(guān)心相關(guān)開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)與監(jiān)管方面難題的解決。由于藥物的潛在免疫原性是生產(chǎn)商和監(jiān)管者都十分關(guān)心的要素，因此如何定義生物藥品的純度與效力要比那些小分子藥物復(fù)雜得多。這反過(guò)來(lái)突顯了業(yè)界對(duì)高質(zhì)量分析工具的迫切需要——希望它們能有助于全面表征出生物藥物顆粒和團(tuán)聚物，同時(shí)對(duì)藥物內(nèi)在顆粒與污染物的理化特性表征也越來(lái)越重視。
測(cè)量的用處何在？
藥物分子從發(fā)現(xiàn)走向早期配方是十分關(guān)鍵的一個(gè)步驟。分子的理化特性是藥物配方與給藥的決定因素；藥物分子的理化特性確定得越早，就能獲得越大的經(jīng)濟(jì)效益——無(wú)論是為了確定上述步驟成功的可能性，還是盡早避免可能的失敗。就這一點(diǎn)而言，比較理想的是能夠在非常少量的樣品上進(jìn)行一系列非破壞性試驗(yàn)，并且把更多的精力放在改善可能用到的測(cè)試過(guò)程中。
從藥物分子理化特性表征到藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程直至最終的成品測(cè)試，發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)蛋白質(zhì)團(tuán)聚物，是藥物開(kāi)發(fā)最重要的步驟，因?yàn)槔斫馑幬锓肿舆@方面的行為對(duì)于藥物產(chǎn)品的配制、穩(wěn)定性和安全性來(lái)說(shuō)都是至關(guān)重要的。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是通過(guò)范德華力、氫鍵、二硫鍵和疏水作用的結(jié)合來(lái)保持的，環(huán)境條件的改變可能會(huì)影響其中的一些或者全部相互作用力——其結(jié)果可能會(huì)引發(fā)團(tuán)聚物非正常的折疊或者對(duì)于溶解性造成負(fù)面影響。在此過(guò)程中，蛋白質(zhì)的活性常常會(huì)消失，也有可能很多團(tuán)聚物會(huì)發(fā)展出免疫原性，從而對(duì)最終治療藥物產(chǎn)品的有效性和安全性造成顯著影響。
當(dāng)前的監(jiān)管預(yù)期是，對(duì)團(tuán)聚物和大小范圍在“0.2- 2”微米級(jí)別1的不溶性微粒進(jìn)行表征。大小超過(guò)幾微米的團(tuán)聚物可以用視覺(jué)方法來(lái)進(jìn)行表征。小于這個(gè)尺寸的，可以采用動(dòng)態(tài)光散射(DLS) 法和體積排除色譜 (SEC) 法等成熟的分析技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)凝聚物進(jìn)行表征。圖1列出了上述方法所采用的技術(shù)和測(cè)量范圍。共振質(zhì)量測(cè)量法 (RMM)是最新發(fā)展的技術(shù)現(xiàn)在也被用來(lái)檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)50 nm到5μm這一至關(guān)重要尺寸范圍內(nèi)的不溶性微粒，并對(duì)它們的浮力質(zhì)量、凈質(zhì)量和粒徑大小進(jìn)行可靠的測(cè)量。共振質(zhì)量測(cè)量法為不溶性微粒和亞微米級(jí)凝聚物提供了測(cè)量窗口。
動(dòng)態(tài)光散射法的使用
動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)量迅速，屬于非侵入性的測(cè)量方式，特別適合在藥物試劑開(kāi)發(fā)的早期階段篩選蛋白質(zhì)。該技術(shù)測(cè)量了布朗運(yùn)動(dòng)下的蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的散射光強(qiáng)度波動(dòng)，并將結(jié)果轉(zhuǎn)化為尺寸與尺寸分布數(shù)據(jù)。這種技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)之一是能夠在最早的階段對(duì)蛋白質(zhì)團(tuán)聚物進(jìn)行檢測(cè)，從而確定生成或者阻止蛋白質(zhì)形成團(tuán)聚物的條件。
蛋白質(zhì)分析過(guò)程應(yīng)該選擇理想的動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)。當(dāng)溶液中蛋白質(zhì)尺寸與散射光波長(zhǎng)相比非常小時(shí)，散射光的強(qiáng)度不再取決于角度，也就是說(shuō)從任何角度進(jìn)行測(cè)量都會(huì)得出相同的結(jié)果。然而隨著蛋白質(zhì)尺寸增大并超過(guò)≈λ/ 10時(shí)，向前的散射光強(qiáng)度開(kāi)始增加，此時(shí)，從合適的角度對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集就變得十分重要。例如，采用配有背向散射檢測(cè)技術(shù)的儀器，通過(guò)測(cè)量前后兩個(gè)方向 (見(jiàn)下列數(shù)據(jù))的散射光強(qiáng)可以對(duì)蛋白質(zhì)團(tuán)聚過(guò)程進(jìn)行有效的監(jiān)控。
應(yīng)用體積排除色譜法
體積排除色譜法 (SEC)，顧名思義，是利用分子在流體力學(xué)尺寸上的差異分離溶解的高分子。通常在生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室會(huì)采用這種方法來(lái)表征純化和重組的蛋白質(zhì)。當(dāng)使用SEC作為分析工具時(shí)，其得到的信息量和有效性取決于和色譜連接的檢測(cè)技術(shù)。
單檢測(cè)SEC采用紫外 (UV) 檢測(cè)儀來(lái)檢測(cè)濃度，依然是測(cè)試所有蛋白質(zhì)團(tuán)聚物的傳統(tǒng)手段，但是功能更為強(qiáng)大的多檢測(cè)系統(tǒng)在這個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域越來(lái)越受到人們的青睞，因?yàn)樗鼈兛梢蕴峁┗パa(bǔ)的信息和對(duì)檢測(cè)結(jié)果綜合解釋。例如，結(jié)合了示差折光檢測(cè)器(RI) 、紫外檢測(cè)器、光散射檢測(cè)器和粘度檢測(cè)器的系統(tǒng)可以對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行全面表征，提供分子量數(shù)據(jù)以及詳細(xì)的結(jié)構(gòu)變化和特征，同時(shí)避免了色譜柱校準(zhǔn)的需要。
圖3顯示了GPC /SEC色譜儀對(duì)牛血清蛋白樣本的檢測(cè)，上面顯示了由RI和光散射檢測(cè)器組成的系統(tǒng)所獲得的響應(yīng)。紅色為RI信號(hào)，在大約25毫升時(shí)反應(yīng)比較明顯，根據(jù)相應(yīng)光散射強(qiáng)度數(shù)據(jù) (綠色) 計(jì)算得到的分子量，可以確定是單體。較早出現(xiàn)的兩個(gè)流出峰，根據(jù)分子量可以確定為二聚體和三聚體。最早出現(xiàn)的峰值處所對(duì)應(yīng)的大量光散射信號(hào)表明，這些是團(tuán)聚物。如果僅僅依靠單個(gè)RI/UV檢測(cè)器系統(tǒng)是對(duì)于所有組成進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量的檢測(cè)是不可能完成的。
引入共振質(zhì)量法測(cè)量
作為分析家族中相對(duì)較新的一員，共振質(zhì)量檢測(cè)方法 (RMM) 檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)樣本中不溶性微粒與亞微米級(jí)微粒的數(shù)量，同時(shí)測(cè)量其粒度尺寸和質(zhì)量分布。由于RMM 是一種計(jì)數(shù)技術(shù)，上述質(zhì)量分布數(shù)據(jù)是在數(shù)字基礎(chǔ)上產(chǎn)生，因此賦予該技術(shù)對(duì)稀疏顆粒群很好的敏感性。
在共振質(zhì)量檢測(cè)儀的核心部位，有一個(gè)微機(jī)電系統(tǒng) (MEMS) 傳感器，傳感器內(nèi)含有微米級(jí)流通道的共振懸臂。當(dāng)粒徑范圍為50 nm - 5μm的單個(gè)顆粒流過(guò)通道時(shí)，懸臂的諧振頻率會(huì)發(fā)生與顆粒浮力質(zhì)量相對(duì)應(yīng)的變化，由此可以從檢測(cè)到的頻率變化中推斷出顆粒的干燥質(zhì)量和粒徑。
與此同時(shí)，MEMS傳感器還能提供關(guān)于樣本濃度、粘度、密度和體積等信息，并能夠檢測(cè)和分辨相對(duì)于溶劑的正負(fù)浮力的顆粒。基于浮力正負(fù)的區(qū)分能力非常有用，比如他可以同時(shí)區(qū)分檢測(cè)被硅油液滴污染的樣品中的硅油成分和蛋白質(zhì)成分 (見(jiàn)圖4)。這是一個(gè)在藥物開(kāi)發(fā)后期和生產(chǎn)中經(jīng)常會(huì)碰到的問(wèn)題，因?yàn)樵谏鲜鰣?chǎng)合中硅油是藥物輸送的注射器經(jīng)常遇到的一種污染物。
共振質(zhì)量檢測(cè)法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，那就是它架起了可見(jiàn)光法和溶液法 (如體積排除色譜法，較難測(cè)出蛋白質(zhì)團(tuán)聚成都) 之間的橋梁。監(jiān)管機(jī)構(gòu)十分希望能對(duì)蛋白質(zhì)的團(tuán)聚物加以可靠的量化和全面的認(rèn)識(shí)，為了滿(mǎn)足上述的分析需求，共振質(zhì)譜法技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，它可以貫穿質(zhì)量控制的整個(gè)過(guò)程，甚至在有常見(jiàn)污染物的情況下也能滿(mǎn)足分析需求。
展望未來(lái)
生物分子固有的復(fù)雜性和可變性對(duì)快速發(fā)展的生物制藥行業(yè)提出了諸多新挑戰(zhàn)。利用現(xiàn)有技術(shù)對(duì)成品中的蛋白質(zhì)顆?；驁F(tuán)聚物進(jìn)行檢測(cè)固然十分重要，但業(yè)界越來(lái)越需要各種有助于了解促進(jìn)上述相互作用的理化機(jī)制、并對(duì)穩(wěn)定配方的開(kāi)發(fā)起到支撐作用的測(cè)量技術(shù)。分析解決方案提供商必須跟上這樣的變化步伐，憑借側(cè)重于測(cè)量全新而又不斷出現(xiàn)的“品質(zhì)屬性”的儀器產(chǎn)品的快速開(kāi)發(fā)，對(duì)行業(yè)需求作出預(yù)見(jiàn)和響應(yīng)。
參考資料
1 演講稿：Susan Kirshner，F(xiàn)DA 生物技術(shù)辦公室。下載地址：點(diǎn)擊下載
結(jié)語(yǔ)
位于美國(guó)賓夕法尼亞州的馬爾文儀器最近推出了一項(xiàng)全球生物科學(xué)發(fā)展項(xiàng)目。這是一個(gè)資源充足并且專(zhuān)注于高端技術(shù)合作開(kāi)發(fā)的項(xiàng)目，與許多生物制藥公司和該領(lǐng)域內(nèi)聲名卓著的學(xué)術(shù)領(lǐng)導(dǎo)人合作。下面的方框里包含了項(xiàng)目的更多細(xì)節(jié)，如需進(jìn)一步了解敬請(qǐng)與我們接洽。
圖1:業(yè)界需要一系列分析技術(shù)，確保對(duì)蛋白質(zhì)凝聚物所有可能的粒徑范圍進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量
圖2: 對(duì)后方(173 度)和前方(12.8 度)的光散射強(qiáng)度同時(shí)進(jìn)行測(cè)量，確保整個(gè)凝聚過(guò)程中的粒徑得到準(zhǔn)確的測(cè)量。
圖3: 采用由RI 和光散射檢測(cè)儀組成的GPC/SEC 系統(tǒng)對(duì)牛血清蛋白進(jìn)行測(cè)量。
圖4: 共振質(zhì)譜法(阿基米德，馬爾文儀器)對(duì)單個(gè)蛋白樣品進(jìn)行了正浮力硅油液滴和負(fù)浮力蛋白質(zhì)凝聚顆粒兩種尺
寸分布進(jìn)行測(cè)量。
（作者：Stephen Ball,，馬爾文儀器產(chǎn)品營(yíng)銷(xiāo)經(jīng)理）
