摘要：光散射檢測(cè)儀能夠直接測(cè)量分子量分布，因此在凝膠滲透色譜以及尺寸排除色譜法分析中起著重要作用。比較常用的是多角度光散射(MALS)檢測(cè)儀，因?yàn)樵谀承┣闆r下，它們能為回轉(zhuǎn)半徑（Rg）的測(cè)量提供最精確的數(shù)據(jù)，而在另外一些情況下MALS已經(jīng)成為公認(rèn)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。馬爾文儀器公司新型Viscotek SEC-MALS 20檢測(cè)儀的推出，豐富了這一領(lǐng)域的產(chǎn)品選擇，并使該項(xiàng)技術(shù)成為業(yè)界矚目的焦點(diǎn)。

 

在本文中，馬爾文儀器將向您介紹MALS檢測(cè)儀的工作原理，總結(jié)它們?cè)谔囟☉?yīng)用中的優(yōu)勢(shì)，并重點(diǎn)介紹那些決定其性能的特點(diǎn)。本文可以作為幫助用戶判斷MALS在何種情況下最為適用的指南，并幫助那些有購(gòu)置檢測(cè)新儀器的用戶作出明智的選擇。

 

Synopsis：Light scattering detectors play an important role in gel permeation chromatography and size exclusion chromatography analysis because of their ability to directly measure molecular weight distribution.

 

Multi angle light scattering (MALS) detectors are often chosen, in some instances because they provide the most accurate data for the measurement of the radius of gyration (Rg), and in others because they have become an accepted industry standard. The launch of the new Viscotek SEC-MALS by Malvern Instruments extends commercial choice in this area and draws the technology into the spotlight.

 

In this article Malvern Instruments explains how MALS detectors work, reviews their benefits for certain applications and highlights specific features that define performance. The resulting article provides a guide as to when MALS is the best choice and helps those investing in a new detector to make an informed choice.

 

關(guān)鍵詞：尺寸排阻色譜法, 凝膠滲透色譜法, 靜態(tài)光散射, 多角度光散射, 分子量測(cè)定, 色譜法, 光散射, 分子量

 

Key Words：Size exclusion chromatography, Gel permeation chromatography, Static light scattering, Multi angle light scattering, Molecular weight measurement, Chromatography, light scattering, molecular weight

 

光散射檢測(cè)器能夠直接測(cè)量分子量分布，因此在凝膠滲透色譜以及尺寸排除色譜法(GPC/SEC）分析中起著重要作用。有的時(shí)候會(huì)選擇多角度光散射(MALS)檢測(cè)器，因?yàn)樵谀承┣闆r下，它們能夠準(zhǔn)確檢測(cè)均方旋轉(zhuǎn)半徑（Rg）的數(shù)據(jù)，而在另外一些情況下MALS已經(jīng)成為公認(rèn)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。馬爾文儀器公司新型Viscotek SEC-MALS 20檢測(cè)器的推出，豐富了這一領(lǐng)域的產(chǎn)品選擇，并使該項(xiàng)技術(shù)成為業(yè)界矚目的焦點(diǎn)。

 

在本文中，馬爾文儀器納米顆粒和分子表征產(chǎn)品經(jīng)理Mark Pothecary將向您介紹MALS檢測(cè)器的工作原理，總結(jié)它們?cè)谔囟☉?yīng)用中的優(yōu)勢(shì)，并重點(diǎn)介紹那些決定其性能的特點(diǎn)。本文可以作為幫助用戶判斷MALS在何種情況下最為適用的指南，并幫助那些有購(gòu)置檢測(cè)新儀器的用戶作出明智的選擇。

 

 

為了精確測(cè)量分子量，GPC/SEC系統(tǒng)中越來(lái)越多地引入了光散射檢測(cè)器，這樣就無(wú)需借助傳統(tǒng)的外部校準(zhǔn)方法。此外，當(dāng)系統(tǒng)與粘度等其它檢測(cè)器結(jié)合使用時(shí)，還可以得到聚合物構(gòu)形構(gòu)像，支化等特征信息。

 

當(dāng)分子被激光照射時(shí)，散射光的強(qiáng)度與其分子量直接相關(guān)，這種關(guān)系可以用瑞利方程來(lái)進(jìn)行描述。如果能夠已知入射光束角度為0°時(shí)的散射光強(qiáng)度，那么瑞利方程的應(yīng)用就能大大簡(jiǎn)化。但是在這個(gè)角度進(jìn)行測(cè)量并不可行，因?yàn)樯⑸涔庑盘?hào)很難與入射光信號(hào)區(qū)分開(kāi)來(lái)。

 

這些年來(lái)，業(yè)界陸續(xù)開(kāi)發(fā)出了多種不同的光散射技術(shù)，以各種不同的方式解決無(wú)法在0°角進(jìn)行物理測(cè)量的難題。在這些方法中可以選擇的檢測(cè)技術(shù)包括：直角光散射（RALS）、小角度光散射（LALS）和多角度光散射（MALS）。根據(jù)分子的光散射行為不同，比如它們是各向同性還是各向異性的光散射體，可以對(duì)其進(jìn)行分類，這對(duì)檢測(cè)器的選擇具有重要的影響。

 

小分子聚合物（通常指大小在10-15nm以下）各個(gè)角度的散射光強(qiáng)度都相同，因此可以在任何角度對(duì)這些各向同性散射體的散射光進(jìn)行檢測(cè)。但是，對(duì)于較大的各向異性散射體，其散射光強(qiáng)度會(huì)受到角度不同的影響，這使得無(wú)法在0°測(cè)量的問(wèn)題更趨復(fù)雜。

 

可以說(shuō)，LALS是適用于所有類型大分子^[1]的最穩(wěn)定可靠的檢測(cè)器。然而，MALS在某些領(lǐng)域的應(yīng)用很廣，這主要是因?yàn)槿藗儗?duì)它能進(jìn)行多種測(cè)量、以及對(duì)回轉(zhuǎn)半徑（Rg）進(jìn)行精確測(cè)量的獨(dú)特能力很有信心。Rg是一種很有用的參數(shù)，它能描述聚合物的大小，其中還包含了分子結(jié)構(gòu)方面的信息。有些行業(yè)，尤其是與蛋白質(zhì)或生物制藥領(lǐng)域相關(guān)的領(lǐng)域甚至對(duì)MALS檢測(cè)法進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于希望對(duì)這種技術(shù)應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化的研究人員而言，掌握MALS檢測(cè)器的工作原理，了解不同檢測(cè)系統(tǒng)的利弊十分重要。

 

 

顧名思義，MALS是對(duì)分子從多個(gè)角度進(jìn)行光強(qiáng)度測(cè)量，而并非局限在單一角度。這些測(cè)量結(jié)果可用于建立散射光隨入射角度變化的函數(shù)模型，從而推斷出0°入射光時(shí)的散射光強(qiáng)度.

 

這種推斷需要采用紀(jì)尼厄圖（也常稱作德拜曲線圖）來(lái)完成。圖1為瑞利比（Rayleigh ratio）圖，即散射光強(qiáng)度值對(duì)入射光角度的函數(shù)曲線圖。圖中的y截距即為入射光在0°時(shí)的光散射強(qiáng)度，而Rg則可根據(jù)斜率計(jì)算得出。

 

圖1：德拜圖描繪了瑞利比作為sin² (θ/2)的函數(shù)關(guān)系。y軸截距等于0°角下的瑞利比。

 

最簡(jiǎn)單的MALS檢測(cè)器僅在兩個(gè)點(diǎn)上對(duì)散射光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，這樣的系統(tǒng)樣品流量最小，樣品保留時(shí)間也最短，并且由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單而成為市面上最便宜的MALS檢測(cè)器。不過(guò)，單憑兩個(gè)角度的檢測(cè)是難以建立起可靠的校正曲線的，尤其是當(dāng)?shù)掳萸€呈非線性的時(shí)候，而這種情況又比較常見(jiàn)。由于上述雙檢測(cè)點(diǎn)系統(tǒng)的數(shù)據(jù)外推質(zhì)量和擬合度較差，因而在多數(shù)情況下這種檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)果可靠性也較低。

 

現(xiàn)代MALS系統(tǒng)傾向于配備數(shù)量較多的檢測(cè)點(diǎn)，最先進(jìn)的系統(tǒng)多達(dá)20個(gè)。因此，它們能夠擬合更加復(fù)雜的散射模式曲線，而不是簡(jiǎn)單的直線。這對(duì)入射角度較小的情況來(lái)說(shuō)特別重要，因?yàn)槿肷浣嵌容^小時(shí)，非線性特性會(huì)對(duì)所測(cè)量的分子量值產(chǎn)生很大的影響。與雙點(diǎn)檢測(cè)產(chǎn)品相比，上述多點(diǎn)檢測(cè)的系統(tǒng)能夠測(cè)得更精確的分子量和Rg數(shù)據(jù)。在選擇檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，檢測(cè)點(diǎn)的數(shù)量通常受到普遍的關(guān)注，但大家也應(yīng)該認(rèn)識(shí)到另外很重要的一點(diǎn)，就是盡管測(cè)量角度的增加使數(shù)據(jù)可靠推斷的可能性大大加強(qiáng)，但入射角度較小時(shí)，檢測(cè)器質(zhì)量才是提高測(cè)量精度的最關(guān)鍵因素。

 

 

隨著MALS系統(tǒng)內(nèi)檢測(cè)點(diǎn)數(shù)量的增加，儀器在技術(shù)上的要求就更為復(fù)雜。在檢測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)中，既要考慮能夠容納多個(gè)點(diǎn)檢測(cè)，又要做到不降低信噪比，這一點(diǎn)至關(guān)重要。為此，制造商開(kāi)發(fā)出一些替代配置，結(jié)合不同的小體積樣品池設(shè)計(jì)及其它一些特點(diǎn)，極大提高了MALS技術(shù)的測(cè)量精度。

 

任何MALS系統(tǒng)都有一個(gè)基本特點(diǎn)，就是配有樣品池，檢測(cè)點(diǎn)對(duì)置于其中的樣品進(jìn)行測(cè)量。傳統(tǒng)MALS系統(tǒng)采用橫向樣品池設(shè)計(jì)，這樣，樣品就會(huì)以水平方式流經(jīng)檢測(cè)點(diǎn)。入射的激光束通過(guò)樣品池端部射入，并按照與樣品流動(dòng)相一致的方向穿過(guò)樣品池。檢測(cè)點(diǎn)被設(shè)計(jì)在流動(dòng)相的同一平面上，并通過(guò)透鏡將光線聚焦其上。

 

圖2：傳統(tǒng)MALS檢測(cè)器采用橫向樣品池，樣品沿入射光束同一平面進(jìn)入該樣品池。

 

橫向樣品池設(shè)計(jì)可容納多個(gè)檢測(cè)點(diǎn)，但不一定具備小角度測(cè)量的最佳敏感度。對(duì)于這種結(jié)構(gòu)，必須使用大樣品池，以容納更多數(shù)量的檢測(cè)點(diǎn)。大樣品池占用的體積會(huì)明顯增加，并限制了檢測(cè)點(diǎn)在低角度位置的可用物理空間。此外，由此造成的較淺入射角和折射角往往會(huì)使小角度測(cè)量的信噪比較差，從而降低測(cè)量精度。最后，由于不同流動(dòng)相會(huì)引起折射率的變化，因此需要采用不同的透鏡來(lái)對(duì)入射角和折射角進(jìn)行校正。

 

以馬爾文的Viscotek SEC-MALS 20為例，較新的MALS檢測(cè)器都已重點(diǎn)采用垂直樣品池，以突破橫向樣品池設(shè)計(jì)固有的局限性。在這種結(jié)構(gòu)中，流動(dòng)相和激光彼此垂直，并且和橫向系統(tǒng)一樣可以容納多個(gè)測(cè)量角度，但這種設(shè)計(jì)可以使小角度測(cè)量具有更大的物理空間，從而提高了準(zhǔn)確測(cè)量的概率。

 

圖3：在垂直樣品池中，光線總是以90°射出池壁，使干擾最小化并且無(wú)需對(duì)折射率進(jìn)行修正。

 

在垂直樣品池設(shè)計(jì)中，散射光垂直于池壁射出，最大限度地減少了流動(dòng)相和池壁界面處產(chǎn)生的干擾，并且流動(dòng)相折射率的變化也不會(huì)對(duì)測(cè)量角度造成影響。這意味著單個(gè)樣品池可以處理任何溶劑或任何一種折射率。

 

 

蛋白質(zhì)聚集被認(rèn)為是生物制藥行業(yè)和其它相關(guān)領(lǐng)域的一個(gè)重要問(wèn)題。蛋白質(zhì)具有隨時(shí)間推移而聚集的傾向，對(duì)多克隆抗體和單克隆抗體等生物藥物而言，蛋白質(zhì)聚集體的存在會(huì)造成降低療效和可能刺激免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。GPC/SEC系統(tǒng)經(jīng)常用于測(cè)量蛋白質(zhì)分子量，并對(duì)出現(xiàn)的任何聚集體進(jìn)行檢測(cè)和表征。下面所舉的案例對(duì)MALS檢測(cè)器在蛋白質(zhì)聚集體研究中的應(yīng)用^[2]進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明。

 

在這一案例中，將一臺(tái)Viscotek SEC-MALS 20檢測(cè)器與一臺(tái)ViscotekTDAmax（均由英國(guó)馬爾文儀器公司制造）相連接，組成了包含多檢測(cè)器陣列的GPC/SEC系統(tǒng)，用來(lái)對(duì)胃蛋白酶樣品進(jìn)行表征。胃蛋白酶是由胃內(nèi)主細(xì)胞產(chǎn)生的酶。在進(jìn)行分析之前，將樣品溶解于磷酸鹽緩沖液組成的流動(dòng)相中。

 

GPC/SEC對(duì)胃蛋白酶樣品的分析顯示出兩個(gè)明顯的峰值。一種組分的分子量測(cè)定為34.5kDa，對(duì)應(yīng)于已知胃蛋白酶的分子量35kDa。另一個(gè)組分的分子量要高得多，認(rèn)定該物質(zhì)為一種聚集體物質(zhì)。還出現(xiàn)了無(wú)法明確識(shí)別的第三個(gè)組分，分子量約為6kDa。作為消化酶，很可能樣本中的胃蛋白酶已經(jīng)開(kāi)始消化自身，第三個(gè)組分表明出現(xiàn)了一些降解產(chǎn)物。

 

圖4 ：胃蛋白酶色譜圖。34.5 kDa的峰值對(duì)應(yīng)胃蛋白酶已知分子量，更早的保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的峰值則由蛋白質(zhì)聚集引起。

 

盡管產(chǎn)生了顯著的光散射峰值，但樣品中聚集體僅占材料總量不到1％。識(shí)別和量化藥物樣品中的這類化合物，對(duì)于藥物開(kāi)發(fā)和遵守嚴(yán)格的藥品監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。

 

雖然胃蛋白酶單體太小，無(wú)法進(jìn)行Rg測(cè)量，但MALS圖表明聚集體材料是一種強(qiáng)烈的各向異性光散射體，因此能夠計(jì)算出聚集物質(zhì)的Rg值（參見(jiàn)表1）。

 

表1 ：進(jìn)行胃蛋白酶分析所需的計(jì)算參數(shù)。使用MALS可以實(shí)現(xiàn)聚集體成分的回旋半徑計(jì)算。

	聚集體	單體	降解產(chǎn)物
RV(保留體積)峰值(ml)	10.84	18.33	20.92
Mn– (kDa)	3892.0	34.4	4.7
Mw – (kDa)	4431.0	34.7	6.4
Mw / Mn	1.138	1.008	1.364
Rg (w) – (nm)	69.9	N/C	N/C
Wt Fr (峰值)	0.008	0.569	0.423

 

 

MALS是目前廣泛應(yīng)用于整個(gè)蛋白質(zhì)、聚合物和高分子表征領(lǐng)域的一種GPC/SEC光散射技術(shù)。MALS在生物制藥行業(yè)十分盛行，而其對(duì)Rg進(jìn)行計(jì)算的能力也在另一些行業(yè)受到了高度重視。因此，如何選擇一臺(tái)合適的MALS檢測(cè)器是擺在許多人面前的一項(xiàng)重要任務(wù)。了解MALS檢測(cè)器器的關(guān)鍵特性，不僅能幫助用戶做出決定，還能幫助用戶真正獲得這一最新創(chuàng)新帶來(lái)的實(shí)際利益和價(jià)值。

 

[1]馬爾文儀器白皮書(shū)《靜態(tài)光散射技術(shù)的GPC / SEC解釋》?？稍L問(wèn)以下網(wǎng)址下載：www.malvern.com/slsforgpc

[2] 馬爾文儀器應(yīng)用筆記《采用Viscotek SEC-MALS 20對(duì)蛋白質(zhì)聚集進(jìn)行測(cè)量》。可訪問(wèn)以下網(wǎng)址下載：www.malvern.com/secmals20

 

 

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