80年代中期，俄羅斯科學院恩格爾哈得分子生物學研究所和美國阿貢國家實驗室(ANL)的科學家們最早在文獻中提出了用雜交法測定核酸序列(SBH)新技術(shù)的想法。當時用的是多聚寡核酸探針。幾乎與此同時英國牛津大學生化系的Sourthern等也取得了在載體固定寡核苷酸及雜交法測序的國際專利。
基因芯片利用微電子、微機械、生物化學、分子生物學、新型材料、計算機和統(tǒng)計學等多學科的先進技術(shù),實現(xiàn)了在生命科學研究中樣品處理、檢測和分析過程的連續(xù)化、集成化和微型化。
1997年世界上第一張全基因組芯片——含有6166個基因的酵母全基因組芯片在斯坦福大學Brown實驗室完成，從而使基因芯片技術(shù)在世界上迅速得到應(yīng)用。
基因芯片技術(shù)主要包括四個基本要點：芯片方陣的構(gòu)建、樣品的制備、核酸分子反應(yīng)和信號的檢測。1、芯片制備，先將玻璃片或硅片進行表面處理，然后使核酸片段按順序排列在芯片上。2、樣品制備，可將樣品進行生物處理，獲取其中的DNA、RNA，并且加以標記，以提高檢測的靈敏度。3、生物分子反應(yīng)，芯片上的生物分子之間的反應(yīng)是芯片檢測的關(guān)鍵一步。通過選擇合適的反應(yīng)條件使樣品中的核酸分子與芯片上的核酸分子反應(yīng)處于最佳狀況中，減少錯配比率。4、芯片信號檢測，常用的芯片信號檢測方法是將芯片置入芯片掃描儀中，通過掃描以獲得有關(guān)生物信息。
基因芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標是將從樣品制備、雜交反應(yīng)到信號檢測的整個分析過程集成化以獲得微型全分析系統(tǒng)(micro total analytical system)或稱縮微芯片實驗室(laboratory on a chip)。使用縮微芯片實驗室，就可以在一個封閉的系統(tǒng)內(nèi)以很短的時間完成從原始樣品到獲取所需分析結(jié)果的全套操作。
近年,基因芯片技術(shù)在疾病易感基因發(fā)現(xiàn)、疾病分子水平診斷、基因功能確認、多靶位同步超高通量藥物篩選以及病原體檢測等醫(yī)學與生物學領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
一、第一代基因芯片
第一代基因芯片基片可用材料有玻片、硅片、瓷片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜和尼龍膜,其中以玻片最為常用。為保證探針穩(wěn)定固定于載體表面,需要對載體表面進行多聚賴氨酸修飾、醛基修飾、氨基修飾、巰基修飾、瓊脂糖包被或丙烯酰胺硅烷化,使載體形成具有生物特異性的親和表面。最后將制備好的探針固定到活化基片上,目前有兩種方法:原位合成和合成后微點樣。根據(jù)芯片所使用的標記物不同,相應(yīng)信號檢測方法有放射性核素法、生物素法和熒光染料法,在以玻片為載體的芯片上目前普遍采用熒光法。
相應(yīng)熒光檢測裝置有激光共聚焦顯微鏡、電荷偶合器( charge coup led devices, CCD)、激光掃描熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描儀等。其中的激光共聚焦掃描儀已發(fā)展為基因芯片的配套檢測系統(tǒng)。經(jīng)過芯片掃描提取雜交信號之后,在數(shù)據(jù)分析之前,首先要扣除背景信號,進行數(shù)據(jù)檢查、標化和校正,消除不同實驗系統(tǒng)的誤差。
對于簡單的檢測或科學實驗,因所需分析基因數(shù)量少,故直接觀察即可得出結(jié)論。若涉及大量基因尤其是進行表達譜分析時,就需要借助專門的分析軟件,運用統(tǒng)計學和生物信息學知識進行深入、系統(tǒng)的分析,如主成分分析、分層聚類分析、判別分析和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析等。
芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)束并不表示芯片實驗的完成,由于基因芯片獲取的信息量大,要對呈數(shù)量級增長的實驗數(shù)據(jù)進行有效管理,需要建立起通行的數(shù)據(jù)儲存和交流平臺,將各實驗室獲得的實驗結(jié)果集中起來形成共享的基因芯片數(shù)據(jù)庫,以便于數(shù)據(jù)的交流及結(jié)果的評估。
典型如SuperArray公司的功能分類基因芯片：
1、引物設(shè)計
SYBR Green可與所有的雙鏈DNA反應(yīng)(包括引物二聚體)，為了使擴增反應(yīng)集中于目的基因，避免非特異性擴增，引物設(shè)計成為關(guān)鍵因素。為得到單一特異的擴增產(chǎn)物，避免擴增出序列相似的非特異性產(chǎn)物，采用BLAST或者其他比對方法，檢測引物在相應(yīng)物種(如人，小鼠或大鼠)全基因組中的特異性。為了保證在相同的PCR條件下(特別是統(tǒng)一的退火溫度)，不同基因均能擴增出相應(yīng)的特異性產(chǎn)物，對引物的CG值，解鏈溫度(Tm)，以及其他化學和物理的特性都進行了優(yōu)化調(diào)整。為了獲得高擴增效率，對擴增片段的長度也進行了優(yōu)化，一般為100到200bp，確保在統(tǒng)一的循環(huán)反應(yīng)的時間范圍內(nèi)，不同基因均能擴增出完整片段。
2、反應(yīng)體系
為避免非特異性擴增，使用化學修飾的熱啟動Taq酶，只有經(jīng)過熱激步驟，Taq酶才能發(fā)揮擴增活性。同時，反應(yīng)體系經(jīng)過優(yōu)化，可最大限度減少引物二聚體形成，并且保證較難擴增的片段都得到極高的擴增效率。
3、定量結(jié)果可靠
在標準的96孔PCR反應(yīng)儀中進行實時定量PCR實驗，為了獲得高通量，無法為每個樣品單獨制備標準曲線。在完全相同的PCR反應(yīng)條件下，希望表達量不同的多個基因均獲得可靠的結(jié)果，需要確保每個基因都有較高的擴增效率，從而可采用簡單的△△Ct方法計算基因表達量。
其靈敏度高，樣品的使用量低，每張芯片使用的總RNA最少可為0.5ng;可觀察到的動態(tài)線性范圍超過105，可以同時檢測表達量差異較大的基因;Ct值的平均差異只有0.25個循環(huán)，可檢測超過兩倍的基因表達量變化。因此，第二代功能分類基因芯片是研究特定信號通路或者一組功能相關(guān)基因表達量的理想方法。
二、第二代基因芯片
盡管基因芯片技術(shù)已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，但仍然存在著許多難題和不足。目標分子的標記是重要的限速步驟，如何繞過這一步是人們一直期望解決的問題。其次是檢測靈敏度不高，重復性差，無法檢測單堿基錯配的基因樣品。再者，待檢測的基因樣品必須經(jīng)過PCR擴增技術(shù)的處理以獲得足夠量的待檢測樣品，使檢測過程相對復雜。我們稱具備以上特征的基因芯片技術(shù)為第一代基因芯片技術(shù)，這些特征充分說明基因芯片技術(shù)本身存在著較大的發(fā)展空間。
第二代基因芯片包括如下幾種：
1. 電極陣列型基因芯片：將微電極在襯底上排成陣列，通過對氧化還原指示劑的電流信號的檢測實現(xiàn)基因序列的識別;
2. 非標記熒光指示基因芯片：利用熒光分子作為雜交指示劑，在不需對靶基因進行熒光標記的前提下，通過對熒光分子的檢測實現(xiàn)基因序列的識別;
3. 量子點指示基因芯片：利用量子點作為雜交指示劑，在不需對靶基因進行熒光標記的前提下，通過對量子點的掃描實現(xiàn)基因序列的識別;
4. 分子燈塔型基因芯片：利用探針DNA片斷的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，獲得單堿基突變檢測的能力。
三、第三代基因芯片
目前，眾多的第三代基因芯片現(xiàn)在也推向了市場。第三代基因芯片代表了測序的最高水平和未來走向。
1、Illumina微珠基因芯片技術(shù)
這是Illumina公司核心技術(shù)之一，博奧生物基于Illumina微珠芯片平臺，推出SNP分型檢測服務(wù)以及定制SNP分型檢測服務(wù)。
它首先用微機電技術(shù)在光纖末端或硅片基質(zhì)上蝕刻出微孔(深度約為3毫米的相同凹槽)，將“微珠池“內(nèi)的微珠“倒”入光纖束微孔，每個微孔恰可容納一個微珠，在范德華力和與微孔壁間流體靜力學相互作用下，微珠以“無序自組裝”的方式在微孔內(nèi)組裝成芯片。每種類型的微珠平均有 30 倍左右的重復。
每一個微珠上都偶聯(lián)有80萬左右拷貝數(shù)的探針。每一個探針由特異的地址序列(對每種微珠進行解碼，29mer)和特異序列(代表不同的檢測信息，如SNP 位點序列、基因序列等)組成。用專利的解碼技術(shù)對芯片上的微珠進行解碼，完成對芯片微珠定位信息的收集和確認，也實現(xiàn)芯片生產(chǎn)過程中100%質(zhì)控。
以四種熒光標記進行16種微珠解碼為例，解碼過程使用與地址序列互補的且分別標記4種熒光染料的探針進行。把標記4種熒光的不同地址序列探針進行組合，每次雜交后探針清洗下來進行下一輪雜交，通過多輪雜交達到指數(shù)型區(qū)分能力。
2、Ion Torrent半導體基因芯片
Ion Torrent半導體基因芯片是最新一代的測序技術(shù)，它的問世給測序技術(shù)的應(yīng)用帶來了激動人心的進展。它采用了半導體技術(shù)和簡單的化學試劑進行DNA測序，而不是使用光作為媒介。在半導體芯片的微孔中固定DNA鏈，隨后依次摻入ATCG。隨著每個堿基的摻入，釋放出氫離子，在它們穿過每個孔底部時能被檢測到，通過對H+的檢測，實時判讀堿基。
Ion Torrent個人化操作基因組測序儀(PGMTM)是第一臺基于半導體技術(shù)的測序儀。與其他測序技術(shù)相比，使用該項技術(shù)的測序系統(tǒng)更簡單、更快速、及更易升級。該測序儀與其他高通量測序儀特征互補，可以迅速完成應(yīng)急服務(wù)項目，縮短服務(wù)周期，增加服務(wù)效率。
3、實時單分子測序基因芯片
太平洋生物科學公司(PacBio)實時單分子測序基因芯片是直接測由DNA聚合酶將熒光標記的核苷酸摻入互補測序模板。該技術(shù)的核心是一個零點啟動模式的波導(Zero-mode Wavelength，ZMW)納米結(jié)構(gòu)的密集排列， 這一排列陣可以進行單個熒光分子的光學審視。
在過去，零點啟動模式波導結(jié)構(gòu)被用于從大量高密度的分子中分辨出單一的熒光分子，還沒有被用于大量平行分析的操作。為使之用于大量平行分析和數(shù)據(jù)輸出通量(測序數(shù)據(jù)生成能力)，太平洋生物科學公司開發(fā)出一種方法，能有效地將零點啟動模式波導結(jié)構(gòu)排到表面上，他們采用了電子束光刻技術(shù)(Electron beam Lithography)和紫外光電子束光刻技術(shù)(Ultraviolet Photo lithography) 以及高度平行的共焦成像系統(tǒng)， 這樣可以對零點啟動模式納米結(jié)構(gòu)中的熒光標記分子進行高靈敏度和高分辨率的探測，并采用了一個沉重的穩(wěn)定平臺來確保良好的光學聚焦效果。
4、納米球基因芯片
全基因組學公司(Complete Genomics)的納米球基因芯片是以雜交和連接反應(yīng)為核心的。當通過雜交和連接進行測序的方法出現(xiàn)以后，全基因組學公司推出了新的樣品處理方法和納米陣列平臺?；蚪MDNA首先經(jīng)過超聲處理，再加上一些接頭，然后模板環(huán)化，酶切。最后產(chǎn)生大約400個堿基的環(huán)化的測序片段，每個片段內(nèi)含有4個明確的接頭位點。環(huán)化片段用Φ29聚合酶擴增2個數(shù)量級。一個環(huán)化片段所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物稱為DNA納米球(DAN nanoball, DNB)。納米球被選擇性地連接到六甲基二硅氮烷處理的硅芯片上。
5、納米孔基因芯片技術(shù)
另外，還在發(fā)展中的納米孔基因芯片技術(shù)是很有潛力的第四代技術(shù)。因為這種方法不再需要光學檢測和同步的試劑洗脫過程了。
這是一種基于納米孔(納米洞)結(jié)構(gòu)的完全不同的測序技術(shù)，單個堿基的讀取可以靠測定經(jīng)由納米級別的孔洞而跨越或透過薄膜的電導率來進行。納米孔技術(shù)可以廣泛地歸納為兩類：生物類和固態(tài)類。
α溶血素是一種能天然性地連接到細胞膜中繼而導致細胞溶解的蛋白質(zhì)，它第一個被用來做成生物納米孔模型。第二類納米孔是以硅及其衍生物進行機械制造而成。 使用這些合成的納米孔可以降低在膜穩(wěn)定性和蛋白定位等方面的麻煩，而這些正是牛津納米孔公司所創(chuàng)立的生物納米孔系統(tǒng)一直遇到的問題。
例如，Nabsys就發(fā)明了一套系統(tǒng)，他們以匯聚的離子束將硅片薄膜打成納米孔，用于檢測與特異性引物進行了雜交的單鏈DNA穿過納米孔時的阻斷電流變化。 IBM創(chuàng)建了一個更為復雜的系統(tǒng)，能有效地使DNA位移暫停，并在暫停的時候通過隧道電流檢測識別每個堿基。
四、基因芯片市場分析
1、國外市場美國illumina公司一家獨大
在SNP芯片研究領(lǐng)域，美國illumina公司毫無疑問是霸主，illumina公司憑借自己開發(fā)的GoldenGate技術(shù)和infinium專利技術(shù)一直在SNP芯片領(lǐng)域處于壟斷地位。
illumina的全基因組表達譜芯片是目前唯一一種可以達到探針30倍重復的表達譜芯片，其他的芯片都只能達到1-8倍技術(shù)重復。因此illumina的全基因組表達譜芯片的重復性是所有芯片中最高的，其重復性R2>0.996，并且基于第三代基因芯片獨特的微珠芯片生產(chǎn)工藝，芯片生產(chǎn)成本較低，信噪比和靈敏度都非常高，其靈敏度≤1:250,000，芯片檢測結(jié)果和qPCR相關(guān)系數(shù)R2=0.97。
因為illumina所占的市場份額越來越多，2012年6月另一基因芯片大廠家Nimblegen公司，正式宣布退出基因芯片市場。
2、國內(nèi)市場剛剛起步
國內(nèi)基因芯片制造水平低，相關(guān)的企業(yè)規(guī)模小、投入也少，遠達不到國外的水平。所以國內(nèi)的相關(guān)公司均以引進國外基因芯片，提供檢測服務(wù)為主。不過，隨著基因芯片的應(yīng)用推廣，一些公司也開始涉足基因芯片制造。
上市公司達安基因，業(yè)務(wù)以體外診斷為主，產(chǎn)品主要是試劑盒，但也開始涉足基因芯片制造。達安基因2013年申報的三個專利：一種用于基因檢測的電路板 ZL201320244125.X;一種電化學基因芯片 ZL201320244116.0;一種基于基因芯片的檢測裝置 ZL201320244734.5。
而另一以基因檢測服務(wù)著稱的大企業(yè)華大基因，則通過收購國外公司進入基因芯片制造領(lǐng)域。美國上市公司Complete Genomics 公司有自己基因芯片和芯片檢測設(shè)備。但該公司2011年的業(yè)績只有2000多萬美元，其基因測序服務(wù)成長大大低于預(yù)期，股票跌破發(fā)行價，最后被中國華大基因收購。
聯(lián)川生物在microRNA芯片領(lǐng)域也小有名氣，也是唯一一家國產(chǎn)的microRNA芯片，該芯片最大的特點就是更新速度極快，一般新的數(shù)據(jù)庫發(fā)表后，第一個將芯片更新到最新版本的就是聯(lián)川生物。illumina公司于2010年退出了microRNA芯片市場，因illumina公司2006年收購了高通量測序領(lǐng)域NO.1的Solexa公司，成為唯一一家即擁有芯片平臺又擁有高通量測序平臺的供應(yīng)商，illumina認為在microRNA領(lǐng)域，高通量測序有不可比擬的技術(shù)優(yōu)勢，必然會取代芯片，所以于2010年停產(chǎn)了microRNA芯片。
