實驗原理

稀釋平板測數(shù)是根據(jù)微生物在高度稀釋條件下固體培養(yǎng)基上所形成的單個菌落是由一個單細胞繁殖而成這一培養(yǎng)特征設(shè)計的計數(shù)方法，即一個菌落代表一個單細胞。計數(shù)時，首先將待測樣品制成均勻的繁殖稀釋液，盡量使樣品中的微生物細胞分散開，使其成單個細胞存在，否則一個菌落就不只是代表一個細胞，再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。經(jīng)培養(yǎng)后，由單個細胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可計算出樣品中的含菌數(shù)。此記數(shù)方法所計算的菌數(shù)是培養(yǎng)基上長出來的菌落數(shù)，故又稱活菌計數(shù)。一般用于某些產(chǎn)品檢定，如根瘤菌劑等產(chǎn)品檢定，生物制品檢驗，土壤含菌量測定及食品、水源的污染程度的檢驗。

自然條件下，微生物常以群落狀態(tài)存在，這種群落往往是不同種類微生物的混合體。為了研究某種微生物的特性或者要大量培養(yǎng)和使用某種微生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。

在自然界中，土壤是微生物生活的良好環(huán)境，其中生活的微生物數(shù)量和種類都是極其豐富的，因此土壤是人類開發(fā)利用微生物資源的重要基地。土壤中的微生物數(shù)量、種類與土壤肥力有關(guān)，肥沃的土壤中多，貧瘠土壤中少。其生理類群則與土壤的其它理化性質(zhì)，如通氣、pH有關(guān)，例如在通氣良好的菜園土中，好氣性微生物占有絕對優(yōu)勢。本實驗以菜園土為材料分離土壤中的好氣性細菌，并進行數(shù)量測定。

分離微生物時，一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、pH、氧氣等要求的不同，供給它們適宜的生活條件，或加入某種抑制劑造成只利于該菌種生長，不利于其它菌種生長的環(huán)境，從而淘汰不需要的菌種。分離微生物常用的方法有稀釋平板分離法和劃線分離法，根據(jù)不同的材料，可以采用不同方法，其最終目的是要在培養(yǎng)基上出現(xiàn)欲分離微生物的單個菌落，必要時再對單個菌落進一步分離純化。在用稀釋平板分離微生物時，還可以同時測定待分離的微生物的數(shù)量。

放線菌與細菌同屬原核微生物，是重要的抗生素產(chǎn)生菌，在土壤中的數(shù)量僅次于細菌，尤其是在有機質(zhì)豐富、透氣性好的中性到微堿性土壤中的數(shù)量較多。本實驗采用高氏一號瓊脂培養(yǎng)基分離和計數(shù)菜園土中的放線菌。

真菌在土壤中的數(shù)量次于細菌和放線菌，主要在有機質(zhì)豐富、透氣性好的偏酸性土壤中較多。分離土壤中的真菌并不難，但由于其菌落大，容易擴展，計數(shù)準確性較低。本實驗采用加有氯霉素或慶大霉素和孟加拉紅的馬丁氏培養(yǎng)基分離及計數(shù)菜園土中的真菌。按一般資料介紹為鏈霉素，但此種抗生素要先配成一定濃度的溶液，且應(yīng)于倒平板前才加入培養(yǎng)基中。在此培養(yǎng)基上，放線菌和細菌被氯霉素或慶大霉素和孟加拉紅所抑制，但大多數(shù)真菌能夠生存，且其菌落受孟加拉紅的抑制而較小，從而避免了某些真菌的擴散蔓延而帶來的數(shù)量上的誤差。

實驗材料

1、活材料：蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。

2、培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；高氏一號瓊脂培養(yǎng)基；加有氯霉素（或慶大霉素）和孟加拉紅的馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基:在1000mL培養(yǎng)基中加入注射用氯霉素2mL，孟加拉紅33.4mg，均于滅菌前加入。

3、材料：肥沃茶園土。

實驗用品

內(nèi)裝15～20個玻璃珠的90mL無菌水、9mL無菌水、直徑9cm的無菌平皿、1mL無菌吸管、天平、稱樣瓶、記號筆、玻璃刮鏟、經(jīng)2mm土壤篩過篩的菜園、天平、試管架、無菌稱量紙、酒精燈、火柴、接種環(huán)、無菌水。

實驗方法

（一）稀釋平板測數(shù)法

1、樣品稀釋液的制備

準確稱取待測樣品10g，放入裝有90mL無菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置搖床上振蕩20min，使微生物細胞分散，靜置20～30s，即成10^－1稀釋液；再用1mL無菌吸管，吸取10^－1稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10^－2稀釋液；再換一支無菌吸管，吸取10^－2稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，也吹吸3次，即成10^－3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成10^－4、10^－5、10^－6、10^－7、10^－8、10^－9等一系列稀釋菌液。

用稀釋平板計數(shù)時，待測菌稀釋度的選擇應(yīng)根據(jù)樣品確定。樣品中所含待測菌的數(shù)量多時，稀釋度應(yīng)高，反之則低。通常測定細菌菌劑含菌數(shù)時，采用10^－7、10^－8、10^－9稀釋度，測定土壤細菌數(shù)量時，采用10^－4、10^－5、10^－6稀釋度，測定放線菌數(shù)量時，采用10^－3、10^－4、10^－5稀釋度，測定真菌數(shù)量時，采用10^－2、10^－3、10^－4稀釋度。