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ELISA技術(shù)綜述

   2024-12-23 BioTNT(冠泰生物)473
ELISA原理
ELISA利用抗原抗體之間專一性結(jié)合之特性,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè);由于結(jié)合與固體承載物(一般為塑膠孔盤)上之抗原或抗體仍可具有免疫活性,因此設(shè)計(jì) 其結(jié)合 機(jī)制後,配合酵素顯色反應(yīng),即可顯示特定抗原或抗體是否存在,并可利用顯色之深淺進(jìn)行定量分析。根據(jù)待測(cè)樣品與結(jié)合機(jī)制的不同,ELISA可設(shè)計(jì)出各種不 同類型的檢測(cè)方式,主要以"三明治法"(sandwich)、"間接法"(indirect)、以及"競(jìng)爭(zhēng)法"(Competitive)三種為主,以下 為各種方法之介紹。
 
ELISA分類
見ELISA的雙抗夾心法原理;
ELISA的雙抗夾心法,又稱"三明治法"。

三明治法常用于檢測(cè)大分子抗原,一般之操作步驟為:
將具有專一性之抗體固著(coating)于塑料孔盤上,完成後洗去多馀抗體;
加入待測(cè)標(biāo)本,標(biāo)本中若含有待測(cè)之抗原,則其會(huì)與塑料孔盤上的抗體進(jìn)行專一性結(jié)合;
洗去多馀待測(cè)標(biāo)本,加入標(biāo)記有酵素之二次抗體,與抗原結(jié)合;
洗去多馀未結(jié)合的二次抗體,加入酵素受體使呈色,以肉眼或儀器讀取顯色結(jié)果。
三明治法分別以兩種抗體對(duì)標(biāo)本中的抗原進(jìn)行兩次專一性辨認(rèn),因此專一性相當(dāng)高,但此待測(cè)抗原必須是多價(jià)抗原,如此才可獲得兩種以上的專一性抗體,以分別進(jìn)行夾心;而且此法需要足夠的表位空間以進(jìn)行抗原抗體的夾心,所以并不適用于半抗原或小分子抗原等分子量較小之標(biāo)的。
 
ELISA雙抗夾心法的衍生方法如ABC法:ELISA的生物素 -親和素系統(tǒng),該產(chǎn)品系列是檢測(cè)方法上的重要革命。生物素/親和素系統(tǒng)用于ELISA一般有三種形式,即橋聯(lián)法(BAB)、標(biāo)記法 (BA)和ABC法,不少學(xué)者用之檢測(cè)了不同的抗原—抗體系統(tǒng)均取得了較好的結(jié)果,其中以BA法和ABC法應(yīng)用較多,敏感性一般比常規(guī)ELISA法高 4~80倍。

所謂ABC技術(shù)是指Avidin : Biotinylated Enzyme Complex Technology,親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù),所謂的ABC系統(tǒng),被普遍視為目前最靈敏、最可靠與最有效的染色系統(tǒng),并被廣泛應(yīng)用于免疫 組織化學(xué)、免疫電鏡、原位雜交與凝集素化學(xué)中。而該系統(tǒng)仍在不斷地發(fā)展,以滿足廣大研究人員的各種不同要求(如多抗原的標(biāo)記檢測(cè))。
 
ELISA的間接法:
 
間接法常用于檢測(cè)抗體,一般之操作步驟為:
將已知之抗原固著于塑膠孔盤上,完成後洗去多馀之抗原;
加入待測(cè)標(biāo)本,標(biāo)本中若含有待測(cè)之一次抗體,則其會(huì)與塑膠孔盤上的抗原進(jìn)行專一性結(jié)合;
洗去多馀待測(cè)標(biāo)本,加入帶有酵素之二次抗體,與待測(cè)之一次抗體結(jié)合;
洗去多馀未結(jié)合的二次抗體,加入酵素受體使酵素顯色,以肉眼或儀器讀取顯色結(jié)果。
 
ELISA的競(jìng)爭(zhēng)法原理;
 
競(jìng)爭(zhēng)法是一種較少用到的ELISA檢測(cè)機(jī)制,一般用于檢測(cè)小分子抗原,其操作步驟為:
將具有專一性之抗體固著于塑膠孔盤上,完成後洗去多馀抗體;
加入待測(cè)標(biāo)本,使標(biāo)本中的待測(cè)抗原與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性結(jié)合;
加入帶有酵素之抗原,此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性結(jié)合,由于塑膠孔盤上固著的抗體數(shù)量有限,因此當(dāng)標(biāo)本中抗原的量越多,則帶有酵素之抗原可結(jié)合的固著抗體就越少,亦即,兩種抗原皆競(jìng)相與塑膠孔盤上抗體結(jié)合,即所謂競(jìng)爭(zhēng)法之由來(lái)。
洗去標(biāo)本與帶有酵素之抗原,加入酵素受體使酵素顯色,當(dāng)標(biāo)本中抗原量越多,代表塑膠孔盤內(nèi)留下的帶有酵素的抗原越少,顏色也就越淺。
當(dāng)需要檢測(cè)無(wú)法獲得兩種以上單一性抗體的抗原,或是不易得到足夠的純化抗體以固著在塑膠孔盤上時(shí),一般會(huì)考慮使用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA。
 
ELISA的商品化試劑盒成分和分類:
在臨床檢驗(yàn)或者科研檢測(cè)中,ELISA 實(shí)驗(yàn)通常有商品試劑盒提供。ELISA試劑盒中有三個(gè)必要的試劑:免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物等。
完整的ELISA試劑盒包含以下各組分:(1)已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);
(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體(結(jié)合物);
(3)酶的底物;
(4)陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品(定性測(cè)定中),參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清(定量測(cè)定中);
(5)酶聯(lián)物(結(jié)合物)及標(biāo)本的稀釋液;
(6)洗滌液;
(7)酶反應(yīng)終止液。
 
1、免疫吸附劑
已包被抗原或抗體的固相載體在低溫(2~8℃)干燥的條件下一般可保存6個(gè)月以上。有些不完整的試盒,僅供應(yīng)包被用抗原或抗體,檢測(cè)人員需自行包被。如BioTNT 網(wǎng)站中,代理的產(chǎn)品,有的是complete的試劑盒,有的是需要再進(jìn)行包被的duoset,或者是其他的說(shuō)法,都是不完整的試劑盒。
 
1.1 固相載體
固相載體在ELISA測(cè)定過程中作為吸附劑和容器,不參與化學(xué)反應(yīng)??勺鱁LISA中載體的材料很多,最常用的是聚苯乙烯。聚苯 乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能,抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性,加之它的價(jià)格低廉,所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料,可制成各種形式。

ELISA載體的形狀主要有三種:微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用,專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板,國(guó)際上標(biāo) 準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測(cè),有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的,放入座架后,大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的 特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè),并可在特制的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果。現(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測(cè),包括加樣、洗滌、保 溫、比色等步驟,對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后,其吸附性能特別是對(duì)免疫球蛋白的吸附性能增加,應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增 多,但用于間接法測(cè)抗體時(shí)空白值較大。
 
良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔 之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,因此,每一批號(hào)的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。 常用的檢查方法為:以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔,洗滌后每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體,保溫后洗滌, 加底物顯色,終止酶反應(yīng)后,分別測(cè)每孔溶液的吸光度??刂品磻?yīng)條件,使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計(jì)算全部讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù) 之差,應(yīng)小于10%。
 
與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體,聚氯乙烯的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄,可剪割,價(jià)廉,但光潔度不如聚苯乙烯板,孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高。
 
為比較不同固相在某一ELISA測(cè)定中的優(yōu)劣,可應(yīng)用如下的試驗(yàn):用其他免疫學(xué)測(cè)定方法選出一個(gè)典型的陽(yáng)性標(biāo)本和陰性標(biāo)本,將它們進(jìn)行一系列稀釋后,在 不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測(cè)定,然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽(yáng)性結(jié)果與陰性結(jié)果差別最大,這種載體就是這一ELISA測(cè)定項(xiàng)目的 最合適的固相載體。

在ELISA中,用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠,表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸 附面積約為200mm2,小珠均為1000mm2,將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者,球型小珠的表面弧度 更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結(jié)合位點(diǎn)的暴露面處于最佳反應(yīng)狀態(tài),因此珠式ELISA的反應(yīng)往往更為靈敏。小珠的另一特點(diǎn)是更易于使洗滌徹底,使用特殊 的洗滌器,使小珠在洗滌過程中滾動(dòng)淋洗,其洗滌效果遠(yuǎn)較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大,小珠的均一性較差。
 
小試管作為固相載體也有較大的吸附表面,而且標(biāo)本的反應(yīng)量也相應(yīng)增加。板式及珠式ELISA的標(biāo)本量一般為00-200ul,而小試管可根據(jù)需要加大反應(yīng)體積,標(biāo)本反應(yīng)量的增加有助于試驗(yàn)敏感性的提高。小試管還可以當(dāng)作比色杯,最后直接放入分光光度計(jì)中比色。
 
也有應(yīng)用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優(yōu)點(diǎn)是表面積極大,反應(yīng)在懸液中進(jìn)行,其速率與液相反應(yīng)近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體,反應(yīng)后用磁鐵的吸引進(jìn)行分離,洗滌方便,試劑盒一般均配以特殊儀器。
 
應(yīng)用于科研領(lǐng)域,定量檢測(cè)的試劑盒,對(duì)固相載體的要求比較高,一般采用nunc 或者costar,或者其他知名品牌的酶標(biāo)板,來(lái)進(jìn)行包被。
 
以下簡(jiǎn)述固相載體和包被過程。
1.2 包被的方式
將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之,包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合 的,靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用力。這種物理吸附是非特異性的,受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。載體對(duì) 不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的,大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán),故更易吸附到固相載體表面。IgG對(duì)聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附 力,其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上,抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外,因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當(dāng)抗原決定簇存在 于或鄰近于疏水區(qū)域時(shí),抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露,在這種情況下,直接包被效果不佳,可以采用間接的捕獲包被法,即先將針對(duì)該 抗原的特異抗體作預(yù)包被,其后通過抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。此間接結(jié)合在固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表面,其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相 抗體的親和層析作用,包被在固相上的抗原純度大大提高,因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法,試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善,重復(fù)性亦佳。間接 包被的另一優(yōu)點(diǎn)是抗原用量少,僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如,在檢測(cè)抗 DNA抗體時(shí),需用DNA作為包被抗原,而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合??蓪⒕郾揭蚁┌逑冉?jīng)紫外線照射(例如30W紫外燈,75cm照射12小 時(shí)),以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質(zhì),如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預(yù)包被,也可提高核酸的結(jié)合力。也可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被,即用親和素先包被載體,然后加入生物素化的DNA,這種包被方法均勻、牢固,已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。

脂類物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合,可將其在有機(jī)溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干,待酒精揮發(fā)后,讓脂質(zhì)自然干固在固相表面??剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。
 
1.3 包被用抗原
用于包被固相載體的抗原按其來(lái)源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動(dòng)物組織、微生物 培養(yǎng)物等,須經(jīng)提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取,一般的細(xì)菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取,蛋白成份抗原可從富含此抗原的 材料中提取等(例如AFP從臍帶血或胎肝中提取)。重組抗原是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原,多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點(diǎn)是除工 程菌成份外,其他雜質(zhì)少,而且無(wú)傳染性,但純化技術(shù)難度較大。以大腸桿菌為質(zhì)粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份,用于ELISA,在反應(yīng)中可出現(xiàn)假 陽(yáng)性,因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點(diǎn)是能用基因工程制備某些無(wú)法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。例如丙型肝 炎病毒(HCV)尚不能培養(yǎng)成功,而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測(cè)抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據(jù)HCV的基因克隆表達(dá)而 制備的重組抗原。在傳染病診斷中,不少重組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應(yīng)用。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某 一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個(gè)抗原決定簇,純度高,特異性也高,但由于分子量太小,往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)(BSA)等偶聯(lián),借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附,間接地結(jié)合到固相載體表面。應(yīng)用多肽抗原的另一 注意點(diǎn)為他僅能檢測(cè)與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個(gè)不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇,因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。 另外,某些微生物發(fā)生變異時(shí)往往發(fā)生抗原結(jié)構(gòu)變化,在這種情況下,用個(gè)別多肽抗原進(jìn)行包被可引起其他抗體的漏檢。

1.4 
包被用抗體
包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性,可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。如免疫用抗原中含有雜質(zhì)(即便是極微量的),在抗血清中將 出現(xiàn)雜抗體,必須除去(可用吸收法)后才能用于ELISA,以保證試驗(yàn)的特異性??寡宀荒苤苯佑糜诎?,應(yīng)先提取IgG,通常采用硫酸銨鹽析和 Sephadex凝膠過濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被,高度純化的IgG性質(zhì)不穩(wěn)定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗(yàn)的敏感性,則 可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高,特異性亦較強(qiáng),因此不需要作吸收和親和層析處理,一般可將腹水作適當(dāng)稀 釋后直接包被,必要時(shí)也可用純化的IgG。應(yīng)用單抗包被時(shí)應(yīng)注意,一種單抗僅針對(duì)一種抗原決定簇,在某些情況下,用多種單抗混合包被,可取得更好的效果。

1.5 
 包被的條件
包被用抗原或抗體的濃度,包被的溫度和時(shí)間,包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定??贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作 為稀釋液,也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后,在4-8℃冰箱中放 置過夜,37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化,每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選 定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。

1.6 
封閉
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú) 關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度較低,吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙,封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙,從而排 斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白,也有用10%的小牛血清或 1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑,其最大的特點(diǎn)是價(jià)廉,可以高濃度使用(5%)。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用, 但由于奶粉的成份復(fù)雜,而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存,因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。

封閉是否必要,取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條 件。并非所有的ELISA固相均需封閉,封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高。一般說(shuō)來(lái),雙抗體夾心法,只要酶標(biāo)記物是高活性的,操作時(shí)洗滌徹底,不經(jīng)封閉也可 得到滿意的結(jié)果。特別是用單抗腹水直接包被時(shí),因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面,業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測(cè)定中,封閉 一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中,在低溫可保存數(shù)月。
 
2.   酶聯(lián)物(結(jié)合物)
結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體(或抗原),是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是 既保有酶的催化活性,也保持了抗體(或抗原)的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體(或抗原)之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?,在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的(未 結(jié)合的)酶或游離的抗體(或抗原)。此外,結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。

2.1   酶
用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求:純度高,催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高,專一性強(qiáng),性質(zhì)穩(wěn)定,來(lái)源豐富,價(jià)格不貴,制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外,它的相應(yīng)底物易于制備和保存,價(jià)格低廉,有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。

在ELISA中,常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶 (alkaline phosohatase, AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中,應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。國(guó)產(chǎn) ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白,含糖量約為18%,分子量為44000,是一種復(fù)合酶,由主酶(酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅 素)結(jié)合而成,是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶無(wú)色糖蛋白在275nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰,輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán),在403nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰。HRP的 純度用RZ(Reinheit Zahl,德文,意為純度數(shù))表示,是403nm的吸光度與280nm吸光度之比,高純度的HRP的RZ≥?.0。

HRP除符合上述的ELISA中標(biāo)記酶的要求外,更有價(jià)格低廉和性質(zhì)較穩(wěn)定的特點(diǎn)。值得注意的是,在選用酶制劑時(shí),除其純度RZ外,更應(yīng)注意酶的活力。 高純度的酶如保存不當(dāng),活力也會(huì)降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示,可用對(duì)底物作用后生成產(chǎn)物量的測(cè)定進(jìn)行試驗(yàn)。

國(guó)外很多ELISA 試劑采用堿性磷酸酶(AP)作為標(biāo)記酶。常用的AP有兩個(gè)來(lái)源,分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來(lái)源的酶生化特性特性略不相同,從大腸桿菌中提取的 AP分子量為80000,酶作用的最適合pH為8.0;用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000,最適pH為9.6。在ELISA中,AP系統(tǒng)的敏感 度一般高于HRP系統(tǒng),空白值也較低,但AP價(jià)格昂貴,制備結(jié)合物所得率也較HRP低。

2 .2  抗原和抗體
制備結(jié)合物時(shí)所用抗體 一般 均為純度較高的IgG,以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用親和層析純的抗體,這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性,可以在高稀釋度進(jìn)行反 應(yīng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。如用F(ab')2進(jìn)行標(biāo)記,則更可避免標(biāo)本中RF的干擾。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多,總的要求是抗原必須是高純度的。

2.3  結(jié)合物的制備
酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種,即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。
(1)戊二醛交聯(lián)法:戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑,它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中,反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。

ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡(jiǎn)便、有效(結(jié)合率達(dá)60%-70%)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的,酶與抗體交聯(lián)時(shí)分 子間的比例不嚴(yán)格,結(jié)合物的大小也不均一,酶與酶,抗體與抗體之間也有可能交聯(lián),影響效果。諏講椒ㄖ校?br> 先將酶與戊二醛作用,透析除去多余 的戊二醛后,再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先將抗體與戊二醛作用,再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的,較一步法 的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度,但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。

(2)過碘酸鹽氧化法:本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物 酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時(shí),過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑,可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián) 結(jié),其最佳比例為:酶/抗體=1-2/1。此法簡(jiǎn)便有效,一般認(rèn)為是HRP最可取的標(biāo)記方法,但也有人認(rèn)為所有試劑較為強(qiáng)烈,各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演。 

按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上,結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)定,因經(jīng)過徹底洗滌,游離 酶可被除去,并不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同,它會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原,從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng) 予純化,去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè),效果更好。純化的方法很多,分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法最為簡(jiǎn)便,但效果并不理想,因?yàn)榇朔ㄖ?能去除留在上清中的游離酶,但相當(dāng)數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取,高效液相層析法可將制備的結(jié)合物 清晰地分成三個(gè)部分:游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得最佳的分離效果,但費(fèi)用較貴。

結(jié)合物制得后,在用作ELISA試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)?工作濃度。使用過濃的結(jié)合物,既不經(jīng)濟(jì),又可使本底增高;結(jié)合物的濃度過低,則又影響檢測(cè)的敏感性。所以必須對(duì)結(jié)合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是 指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí),能維護(hù)一個(gè)低的本底,并獲得測(cè)定的最佳靈敏度,達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。就酶標(biāo)抗體本身而言,它的有效工作濃度 是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗(yàn)時(shí),能得到陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度。例如某一HRP:抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000,表示該制劑經(jīng) 1:5000稀釋后,在與人IgG包被的固相作ELISA試驗(yàn)時(shí),將發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)。但在用于具體的ELISA檢測(cè)中,酶標(biāo)抗體的最適工作濃度受到固相載體 的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度以及整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫度和時(shí)間等的影響,因此必須在實(shí)際測(cè)定條件下進(jìn)行"滴配"選擇能達(dá)到高敏感度的最大稀釋度作 為試劑盒中的工作濃度。

2.4  結(jié)合物的保存
酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì),保存不當(dāng),極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn) 定,冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右,但凍干過程中引起活力的減低,而且使用時(shí)需經(jīng)復(fù)溶,頗為不便。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普 通冰箱的冰格中較長(zhǎng)時(shí)間保存。早期的ELISA試劑盒中的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng),配以稀釋液(見3.2.5)臨用時(shí)按標(biāo)明的稀釋度稀釋成工作 液?,F(xiàn)在較先進(jìn)的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液,使用時(shí)不需再行稀釋,在4-8℃保存期可達(dá)6個(gè)月。由于蛋白質(zhì)濃度較低,結(jié)合物易失活, 需加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素(例如慶大霉素)和防腐劑(HRP結(jié)合物加硫柳泵,AP結(jié)合物可加疊氮鈉),以防止細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.5  結(jié)合物的稀釋液
用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上,在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)(例如1%牛血清白蛋白), 通過競(jìng)爭(zhēng)以抑制結(jié)合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑,如吐溫20,0.05%的濃度較為適宜。在間接測(cè)定抗體時(shí), 血清標(biāo)本需稀釋后進(jìn)行測(cè)定,也可應(yīng)用這種稀釋液。
 
3. 酶的底物

3.1HRP的底物
HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng),最具代表性的過氧化物為H2O2,其反應(yīng)式如下:
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中,DH2為供氧體,H2O2為受氫體。在ELISA中,DH2一般為無(wú)色化合物,經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物,以便作比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯 二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和 ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅 色,用酸終止酶反應(yīng)后,在492nm處有最高吸收峰,靈敏度高,比色方便,是HRP結(jié)合物最常用的底物。OPD本身難溶于水,OPD·2HCL為水溶性。 曾有報(bào)道OPD有致異變性,操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì),與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定,須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中,OPD和H2O2一般 分成二組分,OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式,片劑中含有發(fā)泡助溶劑,使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中,有制成易保存的濃縮液,使用時(shí)用蒸 餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。

TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色,目視對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定,可配成溶液試劑,只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液,可直接作底物使用。另 外,TMB又有無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn),因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后,TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色,可在比色計(jì)中定量,最適吸 收波長(zhǎng)為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感,但空白值極低,也為一些試劑盒所采用。

另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA],經(jīng)HRP作用后,產(chǎn)物顯熒光,可用熒光光度計(jì)測(cè)量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測(cè)定的線性范圍。

HRP對(duì)氫受體的專一性很高,僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應(yīng)用最多,但尿素過氧化物為 固體,作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑,用蒸餾水溶解后,在底物緩沖液中密閉、低溫(2~8℃)可穩(wěn)定1年。

3.2 AP的底物
AP為磷酸酯酶,一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物,可制成片劑,使用方便。產(chǎn)物為黃色 的對(duì)硝基酚,在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后,黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物(磷酸4-甲基傘酮),可用于ELISA作熒光 測(cè)定,敏感度較高于用顯色底物的比色法。 
4.     洗滌液 
在板式ELISA中,常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。

5.     酶反應(yīng)終止液
常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸,其濃度按加量及比色液的最終體積而異,在板式ELISA中一般采用2mol/L。
 
6.   
陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品
陽(yáng)性對(duì)照品(positive control)和陰性對(duì)照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品,同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì) 照,因此對(duì)照品,特別是陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測(cè)定,對(duì)照品最好也為人血清,因?yàn)檎H搜逶诟鞣N ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到,國(guó)外試劑盒中的對(duì)照品多以復(fù)鈣人血漿 (recalcified human plasma)為原料,即在血漿中加入鈣離子,使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固,除去凝塊后所得的液體,其組成與血清相 似。陰性對(duì)照品須先行檢測(cè),確定其中不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg,最好抗HBs也是陰性。陽(yáng)性對(duì)照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì),其中加入一定量的待檢物質(zhì),此量最好在試劑說(shuō)明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱,在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較, 可對(duì)標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個(gè)粗略的估計(jì)。國(guó)外檢測(cè)HBsAg的ELISA試劑盒檢測(cè)敏感度約為0.5ng/ml,陽(yáng)性對(duì)照品中含量約為10ng/ml。 在對(duì)照品中一般加入抗生素和防腐劑,以利保存。

7.    參考標(biāo)準(zhǔn)品
定量測(cè)定的ELISA試劑盒(例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測(cè)定等)應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品,應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度,一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。
 
其他內(nèi)容:
酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)的多酶級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng):
 
一、AP底物放大系統(tǒng)
substrate ampiification system
AP可催化底物NADP+脫磷酸而生成NAD+(輔酶1),以乙醇作還原劑,在醇脫氧酶催比下,乙醇脫氫,NAD+還原為NADH,NADH在黃遞酶的催 化下脫氫,同時(shí)四唑鹽(tetrazoliim)被還原成有色的甲蠟(formazan)。AP不斷催化NAD+生成,NAD+與NADH循環(huán)轉(zhuǎn)化,不斷 生成甲蠟。整個(gè)反應(yīng)周期由AP及醇脫氫酶、黃遞酶組成酶級(jí)聯(lián),每個(gè)AP分子每分鐘可催化生成6X104個(gè)NAD+分子,而每個(gè)NAD+每分鐘又可使60個(gè) 甲臘分子產(chǎn)生。這種由Selfl984年首次報(bào)道的EIA放大系統(tǒng)可使EIA的測(cè)定敏感性提高約250倍。
 
但Brooks等發(fā)現(xiàn)上述底物反應(yīng)循環(huán)中產(chǎn)生的乙醛對(duì)整個(gè)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)有抑制作用,影響放大效果,而當(dāng)加入鹽酸氨基脲時(shí),則可進(jìn)一步延長(zhǎng)反應(yīng)循環(huán),從而增加 測(cè)定敏感性,這是因?yàn)辂}駿氨基脲可與乙醛反應(yīng)生成縮氨基脲(semicarbatone)和水,這樣就消除了乙醛對(duì)反應(yīng)的抑制阼用。應(yīng)用這種改進(jìn)方法測(cè)定 食物中含蛋白A的金黃色葡萄球菌,測(cè)定敏感性從Self原方法的(4~6)X103菌落形成單位(c.{.u)/g或m1,到20個(gè)菌落形成單位 (c.f.u)/g或ml,測(cè)定敏惑性約提高200—300倍。
 
后來(lái)Self等又用刃天青(resazurin)代替其原來(lái)放大模式中的四唑鹽,刃天青在黃遞酶的作用下成為發(fā)出熒光的resorufin,然后使用熒光比色計(jì)測(cè)定得到結(jié)果。這種方式的測(cè)定敏感性也較原始方法大為提高,每孔內(nèi)僅含約350個(gè)AP分子也可測(cè)出。
 
二、雙酶級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)
dual-enzyme cascade雙酶級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)又稱酶抑制級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng),酯酶抑制劑4—(3—氧—4,4,4—三氟丁基)苯磷駿鹽因其帶有封閉性—P04基團(tuán),對(duì)酯酶不具抑制活性,但 當(dāng)其在AP作用下脫—PO4基時(shí),失活的抑制劑即成為具活性的抑制劑,使加入的羧酸酯酶失活,通過顯色反應(yīng)測(cè)定殘留的酯酶活性即可知原始AP的活性,二者 成反比相關(guān)。這種放大系統(tǒng)的測(cè)定敏感性較普通方法可提高約125倍。
 
三、酶激活級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)
enzymeactivationcascade這亦是一種以AP為標(biāo)記酶的放大系統(tǒng)。黃素—腺嘌呤二核苷酸磷酸(FADP)在AP的催化下脫磷酸為FAD,F(xiàn)AD則使脫輔基的氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化為全酶的 氨基酸氧化酶,后者催化晡氨酸生成H2O2,于是在DCHBS,4AAP及HRP存在下,得到有色產(chǎn)物。上述放大系統(tǒng)可測(cè)定l{mol/LAP。

此外,催化指示物沉著(catalyzedreporterdeposition,CARD)也是一種多酶級(jí)聯(lián)EIA放大系統(tǒng)。HRP氧化生物素或熒光素 標(biāo)記的酪胺所產(chǎn)生的游離基,可與固相上蛋白的酪氨酸、色氨酸反應(yīng)而使大量的生物素或熒光素沉著于固相上HRP周圍的區(qū)域內(nèi),沉著的生物素可用HRP及6— 半乳糖苷酶或AP標(biāo)記的鏈霉親合素測(cè)定,沉著的熒光素則可用酶標(biāo)抗熒光素測(cè)定。這樣使得一分子HRP轉(zhuǎn)化為大量的標(biāo)記物,從而大為改善(約30倍)EIA 的測(cè)定敏感性。Diamandis等使用螯合的Eu3+鏈霉親合素—甲狀腺球蛋白試劑替代上述酶標(biāo)物測(cè)定AFP,不但提高了測(cè)定敏感性,而且也使背景“噪 聲”較普通方法改善了6~8倍。我們將上述CARD放大系統(tǒng)直接用于HBsAg商品ELISA試劑盒,在不改變商品試劑盒任何成分和操作步驟的情況下,可 將試劑盒的測(cè)定敏感性提高約5倍。
 
四、凝固因子酶級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)
脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)可激活鱟血細(xì)胞裂解物的凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)。首先LPS使因子C激活為C,后者又激活因子B為B,B使 前凝固酶轉(zhuǎn)化為凝固酶,凝固酶則催化底物(Boc-Le,u-Gly-Arg-p)產(chǎn)生有色的對(duì)硝基苯胺(曠 nitroa·niline,PNA),A405nm測(cè)定。因此,在免疫測(cè)定中,如以LPS作為標(biāo)記物標(biāo)記抗體,則可通過上述反應(yīng)使測(cè)定敏感性放大,可檢 出10-7~10-11g/m1的IgG和10-7~10-11g/ml的抗IgG,Seki等將上述方法用于雙夾心法檢測(cè)HBsAg,敏感性達(dá) 10-10~10-12g/ml。
 
五、免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移兩位點(diǎn)酶免疫試驗(yàn)
一般來(lái)說(shuō),在酶免疫測(cè)定中,限制測(cè)定敏感性的一個(gè)重要因素是非特異地結(jié)合于固相的標(biāo)記酶的顯色反應(yīng),因其會(huì)使背景顯色加深,從而掩蓋了低濃度待測(cè)物所致的 特異顯色,解決這個(gè)問題提高測(cè)定敏感性的一條途徑是將待測(cè)物——抗體—酶復(fù)合物從固相上洗提至另一個(gè)固相,使用一雙標(biāo)抗體[如生物素和二硝基苯(DNP) 標(biāo)記的抗體]和一酶標(biāo)抗體即可達(dá)到這個(gè)目的,在液相中形成的免疫復(fù)合物(雙標(biāo)抗體:抗原:抗體:酶)捕獲于DNPIgG包被的聚苯烯珠上,洗滌后,使用二 硝基苯—L—賴氨酸將其從固相上取代下來(lái),然后再將上述免疫復(fù)合物捕獲于鏈霉親合素包被的聚苯烯珠上,最后進(jìn)行酶反應(yīng)顯色測(cè)定。Hashida和 shikawa使用該方法測(cè)鐵蛋白敏感性達(dá)到1zeptomole(1X10-21mol,約600個(gè)分子),較常規(guī)方法提高了30倍。眾多的研究者用該 方法測(cè)定抗甲狀腺球蛋白IgC及抗HTLV—1 IgG和抗HIV-1 IgG,敏感性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)地超過常規(guī)方法,取得了良好的效果。
 
此外,Domingo和Marco等在進(jìn)行點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)時(shí),以4—氯—1—萘酚作為HRP的底物,反應(yīng)后得到的不可溶產(chǎn)物因其具有特殊的紫外吸收及熒光 幻滅特征而可在紫外燈下觀察結(jié)果。由于沉著于膜上的物質(zhì)是HRP反應(yīng)的中間產(chǎn)物,而非可見光下能見到的最終產(chǎn)物,所以可大幅度地提高這種固相免疫測(cè)定的敏 感性,較常規(guī)方法約增加100倍。至于酶脂質(zhì)體放大系統(tǒng)(1iposomeamplificationsystem),也是一種新型高效的EIA測(cè)定放大 系統(tǒng)。
 
綜上所述,EIA測(cè)定放大方式雖然多種多樣,且不斷推陳出新,但研究者的出發(fā)點(diǎn)無(wú)非是一方面極力降低影響測(cè)定敏感性的非特異顯色,如通過 增加操作步驟而達(dá)到上述目的的免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移兩位點(diǎn)酶免疫試驗(yàn);另一方面則是通過質(zhì)量提高的信號(hào),從而達(dá)到提高敏感性的目的,如增加反應(yīng)層次的生物素—親 合素,多酶級(jí)聯(lián)等放大系統(tǒng)。但嚴(yán)格地講,真正稱得上是EIA測(cè)定放大系統(tǒng)的僅限于后者,前者還只能說(shuō)是一種所謂的超敏感 EIA(uhrasensitive enzyme immunoassay)。至于利用酶反應(yīng)產(chǎn)物特征改變檢測(cè)手段(如發(fā)光或熒光檢測(cè))而使EIA測(cè)定敏感性提高,則只不過是依靠?jī)x器開闊了“視野“而已。
 
標(biāo)簽: ELISA技術(shù)
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