圖中展示的就是構(gòu)成酵母線粒體大核糖體亞單位(yeast mitochondrial large ribosomal subunit)的各個(gè)組成蛋白質(zhì)。Amunts等人根據(jù)利用低溫冷凍電鏡技術(shù)獲得的酵母線粒體大核糖體亞單位及完整核糖體的結(jié)構(gòu)圖譜，一個(gè)個(gè)地合成出了上述這些組分蛋白。這個(gè)經(jīng)過(guò)不斷完善的結(jié)果與根據(jù)X線晶體成像技術(shù)獲得的原子模型非常吻合。

　　先進(jìn)的低溫冷凍電鏡(cryo–electron microscopy)技術(shù)讓我們獲得了大量高分辨率的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)圖。

　　結(jié)構(gòu)生物學(xué)(structural biology)研究的主要目的就是獲得用于構(gòu)成活體細(xì)胞的各種各樣大分子(macro-molecules)生物組件的高分辨率圖像信息。該研究主要依賴的技術(shù)手段就是X線晶體照相術(shù)(x-ray crystallography)以及核磁共振光譜分析檢測(cè)技術(shù)(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR spectroscopy)。不過(guò)這兩種技術(shù)都有各自的局限性，比如X線晶體照相術(shù)只能夠?qū)ιL(zhǎng)得極為有序的三維結(jié)晶進(jìn)行觀察，而核磁共振光譜分析檢測(cè)技術(shù)則要求被檢測(cè)樣品的純度非常高，不能夠有重疊峰出現(xiàn)。有很多生物大分子相互結(jié)合、組裝之后形成的都是非常大的，或者非常不穩(wěn)定、比較罕見(jiàn)的結(jié)構(gòu)，都不太適合用上述這兩種技術(shù)進(jìn)行分析和檢測(cè)。單粒子電子顯微鏡技術(shù)(Single-particle electron microscopy, EM)則能夠觀察少量非結(jié)晶樣品，獲得高分辨率的結(jié)構(gòu)圖譜。

　　使用單粒子電子顯微鏡技術(shù)可以獲得任意排列方向的分子復(fù)合體( molecular complexes)的結(jié)構(gòu)圖像。該技術(shù)會(huì)從每一幅圖像中選出單個(gè)的復(fù)合體(粒子)，然后借助計(jì)算機(jī)來(lái)判斷它們的排列方向。最后將各個(gè)不同視角的圖像組合在一起，得到該分子的三維立體圖像。不過(guò)由于高能電子束會(huì)對(duì)生物大分子起到破壞作用，打斷分子內(nèi)的共價(jià)鍵(covalent bonds)，并且誘發(fā)一系列級(jí)聯(lián)式的有害化學(xué)反應(yīng)，所以這種放射性損傷效應(yīng)給單粒子電子顯微鏡技術(shù)帶來(lái)了極大的局限性，在實(shí)驗(yàn)時(shí)用來(lái)記錄影像的電子束的能量受到了非常大的約束。

　　20世紀(jì)80年代，Dubochet等人報(bào)道了一種單粒子電子顯微鏡技術(shù)革新成果，將該技術(shù)引向了高分辨率成像之路。他們?cè)诘蜏貤l件(cryogenic conditions)下將待檢樣品放在一層薄薄的、透明的冰上用單粒子電子顯微鏡進(jìn)行成像觀察。這種方法就是所謂的“低溫冷凍電鏡技術(shù)(cryo–electron microscopy, cryo-EM)”，他能夠?qū)牧Ｗ?hydrated particles)進(jìn)行直接成像。低溫除了具有這些優(yōu)勢(shì)之外，還能夠減少電子束對(duì)樣品產(chǎn)生的放射性損害。不過(guò)電子束的照射量還是不能夠太大，只有這樣才能夠清晰地反映出分子結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)，獲得高質(zhì)量的、低信噪比(signal-to-noise ratio, SNR)的三維結(jié)構(gòu)圖像。由于將每個(gè)分子的多張圖像信息組合在一起能夠更進(jìn)一步地降低圖像的信噪比，所以，對(duì)數(shù)萬(wàn)、乃至數(shù)百萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn)行分析就會(huì)產(chǎn)生數(shù)十萬(wàn)張圖像。

　　不過(guò)依靠低溫冷凍電鏡圖像來(lái)判斷生物大分子的結(jié)構(gòu)給計(jì)算機(jī)處理分析工作帶來(lái)了一大挑戰(zhàn)。在借助多圖像組合平均手段來(lái)改善信噪比時(shí)，必須知道每一顆粒子的方向，但是由于信噪比太低，我們對(duì)這些粒子方向的判斷又明顯感覺(jué)準(zhǔn)確性不夠，這就形成了一個(gè)矛盾。要解決這個(gè)問(wèn)題，最成功的方法就是“重復(fù)(iterative)”，質(zhì)量高的圖像能夠給出更準(zhǔn)確的方向信息，而這些方向信息又可以幫助我們獲得更高質(zhì)量的圖像。

　　直到最近這一段時(shí)間，絕大部分單粒子低溫冷凍電鏡圖片的分辨率都非常低，連10埃都達(dá)不到，所以很多人都將這種技術(shù)嘲笑為 “一團(tuán)漿糊學(xué)(blob-ology)”。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α螺旋(α helices)結(jié)構(gòu)只有在分辨率達(dá)到9~10埃，甚至更高分辨率的情況下才能夠看清;而另外一種二級(jí)結(jié)構(gòu)，β折疊(β strands)結(jié)構(gòu)則只有在分辨率達(dá)到4.8埃以上時(shí)才能夠看清。達(dá)到3.5埃的分辨率，就可以為蛋白質(zhì)或核酸等生物大分子構(gòu)建原子模型(atomic models)，將各種目前已知的核酸結(jié)構(gòu)或氨基酸結(jié)構(gòu)填入其中了。如果要了解蛋白質(zhì)復(fù)合體形成時(shí)發(fā)生的各種化學(xué)變化，就必須獲得原子級(jí)別分辨率的細(xì)節(jié)信息。低分辨率的結(jié)構(gòu)信息也不是一無(wú)是處，當(dāng)在與高分辨率結(jié)晶圖像相互配合、印證，用來(lái)判斷組成復(fù)合體的各種不同組分時(shí)更加有意義。因此，即便分辨率較低，低溫冷凍電鏡技術(shù)也還是幫助科學(xué)家們解決了很多生物學(xué)難題，比如解析出了與其他輔因子共同結(jié)合的核糖體的結(jié)構(gòu)問(wèn)題，以及構(gòu)象只能夠維持片刻時(shí)間的核糖體瞬時(shí)結(jié)構(gòu)等問(wèn)題。

　　在過(guò)去的三十年，低溫冷凍電鏡設(shè)備取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，在樣品制備、成像、計(jì)算機(jī)處理等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面有了一定的提升，這些使低溫冷凍電鏡成像技術(shù)的分辨率有了極大的提高。高度連貫的場(chǎng)發(fā)射電子槍(Highly coherent feld-emission electron guns)也使保留焦點(diǎn)以外的圖像的高分辨率信息成為可能，這對(duì)于單粒子低溫冷凍電鏡非常有幫助。這種技術(shù)創(chuàng)新幫助科研人員獲得了20面體病毒粒子(icosahedral virus particles)的圖像，而且清楚地看到了其中的α螺旋結(jié)構(gòu)。由于這種病毒是高度對(duì)稱的，所以比較容易生成高質(zhì)量的、最佳分辨率的低溫冷凍電鏡圖像。

　　隨著研究人員不斷地開(kāi)發(fā)出更穩(wěn)定的載物臺(tái)、更好的顯微鏡抽真空技術(shù)，以及自動(dòng)化的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，這一切的技術(shù)進(jìn)步都讓我們能夠獲得更多、質(zhì)量更好的電鏡圖像，因此才能夠得到高質(zhì)量的、能夠?qū)ζ渲械陌被醾?cè)鏈進(jìn)行解析的二十面體病毒粒子三維結(jié)構(gòu)圖像，以及分辨率達(dá)到5埃的核糖體結(jié)構(gòu)圖像。不過(guò)在對(duì)更小一點(diǎn)的非對(duì)稱粒子的解析工作中還是很難解析到α螺旋結(jié)構(gòu)。

　　最近在低溫冷凍電鏡設(shè)備領(lǐng)域取得的最大進(jìn)展就是引入了直接檢測(cè)設(shè)備(direct detector device, DDD)照相機(jī)。這種DDD設(shè)備能夠直接在傳感器上記錄圖像，從而繞過(guò)了傳統(tǒng)的、需要閃爍設(shè)備和光纖的電荷耦合裝置(charge-coupled device, CCD)探測(cè)器，以及其他一些在用攝影膠片(photographic film)記錄圖像時(shí)必須要經(jīng)過(guò)的繁雜的處理過(guò)程。因此，圖像的信噪比也得到了極大的提升。在分辨率方面的提升也與之前的一些革新手段相當(dāng)。在使用了DDD設(shè)備之后，還有可能在電鏡圖像中直接構(gòu)建原子模型，甚至能夠在最具挑戰(zhàn)性的檢測(cè)工作中進(jìn)行α螺旋和β折疊的解析工作。

　　DDD設(shè)備的引入還在另外一個(gè)方面對(duì)低溫冷凍電鏡的圖像起到了改善作用，憑借的就是該設(shè)備極快的讀出速度(readout rate)，該讀出速度能夠發(fā)現(xiàn)被冰包裹的被觀測(cè)粒子在電子束中的運(yùn)動(dòng)情況。使用DDD設(shè)備不僅能夠發(fā)現(xiàn)這種問(wèn)題，還能夠解決這種問(wèn)題，因?yàn)楝F(xiàn)在的電鏡就好像是一臺(tái)攝像機(jī)，可以拍攝一段錄影，記錄整個(gè)過(guò)程，而不再像以前那樣，只是一臺(tái)照相機(jī)，只能夠拍攝出一張張固定的圖像。

　　有了高質(zhì)量的圖像，又有可以借助計(jì)算機(jī)對(duì)因?yàn)殡娮邮莆坏牧Ｗ舆M(jìn)行矯正的工具，我們就可以獲得大量高質(zhì)量的低溫冷凍電鏡圖像，比如本文開(kāi)頭展示的那張分辨率高達(dá)3.2埃的線粒體核糖體亞單位圖像，以及下圖那張分辨率達(dá)到3.3埃的20S蛋白酶體圖像和哺乳動(dòng)物感受器通道TRPV1的圖像。 TRPV1的圖像尤其值得一提，因?yàn)門RPV1蛋白是一種膜蛋白，只有四級(jí)對(duì)稱性(four-fold symmetry)，比核糖體要小一個(gè)數(shù)量級(jí)。所以之前大家一直都認(rèn)為很難用低溫冷凍電鏡對(duì)該蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析的研究工作。有了 DDD成像技術(shù)、更好的計(jì)算機(jī)輔助和生物化學(xué)技術(shù)之后，Liao等人終于在某些區(qū)域獲得了分辨率高達(dá)3.4埃的圖像，從而有機(jī)會(huì)開(kāi)展原子建模工作，在整個(gè)結(jié)構(gòu)生物學(xué)(structural biology)發(fā)展歷史上寫(xiě)下了重重的一筆。

　　單粒子低溫冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析圖。左圖展示的是隨機(jī)排列的蛋白質(zhì)粒子在電鏡下的圖像，這些圖像經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)處理之后可以用來(lái)計(jì)算大分子復(fù)合物的三維立體結(jié)構(gòu)圖像。由于有了DDD技術(shù)，左邊的這些圖像信息就可以構(gòu)建出右圖中展示的原子模型。圖中展示的就是20S蛋白酶體的結(jié)構(gòu)圖。

　　乍一看上去，這些成果都好像是特例。比如核糖體里由于含有大量的RNA，所以是一幅高度緊縮的圖像，非常緊密，不太容易受到輻射的損失。而20S蛋白酶體擁有14級(jí)對(duì)稱性，所以也非常適于進(jìn)行低溫冷凍電鏡成像操作。即便是TRPV1通道蛋白也都擁有一定的內(nèi)部對(duì)稱性。但是最近剛剛成功獲得的一幅電鏡圖像就完全不具備上述這些“先天優(yōu)勢(shì)”，這就是分辨率達(dá)到4.5埃的人γ分泌酶復(fù)合物(γ-secretase)的結(jié)構(gòu)圖。人γ分泌酶復(fù)合物是一種更小的膜蛋白復(fù)合體，完全沒(méi)有對(duì)稱性。該成果說(shuō)明，只要待測(cè)樣品能夠準(zhǔn)備得恰當(dāng)，盡可能減少其在結(jié)構(gòu)上的異質(zhì)性，我們就完全有可能利用低溫冷凍電鏡技術(shù)獲得各種蛋白質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)圖。

　　這些科研新進(jìn)展恰好出現(xiàn)在低溫冷凍電鏡技術(shù)的低谷期。最近剛剛獲得的HIV-1病毒糖蛋白三聚體結(jié)構(gòu)模型就引起了極大的爭(zhēng)議，因?yàn)槎辔浑婄R專家都堅(jiān)持認(rèn)為，這個(gè)結(jié)構(gòu)模型不僅在結(jié)構(gòu)上不準(zhǔn)確，就連用來(lái)進(jìn)行分析的原始圖像也都沒(méi)有真實(shí)地反映該三聚體的真實(shí)信息。這場(chǎng)爭(zhēng)論也讓我們意識(shí)到，我們目前的確沒(méi)有太多的手段對(duì)低溫冷凍電鏡圖像的質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證，雖然有一些手段，但是都沒(méi)有得到廣泛的推廣和應(yīng)用，另外也缺乏一套規(guī)范，圖像的信號(hào)非常差，所以也很難判斷最終得出的結(jié)構(gòu)圖是否就是被測(cè)樣品的結(jié)構(gòu)。這是一個(gè)非常值得關(guān)注的問(wèn)題，不僅僅是因?yàn)檫@次的HIV-1病毒糖蛋白三聚體結(jié)構(gòu)模型具有重大的科研價(jià)值，比如在HIV疫苗的開(kāi)發(fā)工作中會(huì)起到非常重要的指導(dǎo)作用等。

　　在結(jié)構(gòu)解析方面還有大量的工作需要我們?nèi)ネ晟疲悍奖闶褂玫娘@微鏡相板(phase plates)有助于更好地聚焦，獲得高對(duì)比度的圖像，就好像相襯光學(xué)顯微鏡(phasecontrast light microscopy)那樣，這能夠讓對(duì)圖像進(jìn)行信息采集的工作更加簡(jiǎn)便，而且質(zhì)量更高。另外在探測(cè)器方面也可以進(jìn)一步提高圖像的質(zhì)量。即便是最先進(jìn)的探測(cè)器也達(dá)不到符合理論要求的表現(xiàn)。各種用來(lái)進(jìn)行圖像分析的計(jì)算機(jī)軟件，比如用來(lái)矯正電子束相關(guān)移位的軟件，或者對(duì)各種粒子進(jìn)行分類、解讀的軟件也將會(huì)變得越來(lái)越強(qiáng)大。新型的樣品承載系統(tǒng)會(huì)進(jìn)一步減少電子束對(duì)樣品的位移作用。更加可靠的、更加強(qiáng)大的驗(yàn)證工具可以讓我們更

　　有信心，保證不會(huì)納入質(zhì)量不高的原始圖片素材。雖然現(xiàn)在還不知道低溫冷凍電鏡技術(shù)未來(lái)會(huì)走向何方，但是有一點(diǎn)是可以肯定的，那就是低溫冷凍電鏡圖像絕對(duì)不再是一團(tuán)漿糊了。