預(yù)測和測量蛋白質(zhì)聚集，是生物制藥配方中的一個(gè)重大難題。Lisa Newey-Keane博士描述了一種新型分析方法，可以方便地研究蛋白質(zhì)的聚集。

 

由于在藥物研發(fā)總體經(jīng)費(fèi)支出中，生物分子研究工作所占的比重越來越大，因此分析測試在迅速發(fā)展的生物制藥行業(yè)受到廣泛關(guān)注。這些分子開發(fā)不僅成本高昂，而且受到嚴(yán)格監(jiān)管，所以急需更適合、更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆治鰷y量方法。很多業(yè)內(nèi)人士都提到，分析瓶頸是一個(gè)很令人擔(dān)心的問題，可能會(huì)限制藥物的開發(fā)。

 

與小分子藥物不同，蛋白質(zhì)制劑是非合成或非結(jié)晶的，且本質(zhì)上是不均勻的。正因?yàn)槿绱?，?duì)生物療法的純度和效力做出判定，要比對(duì)非生物分子復(fù)雜得多。例如，雜質(zhì)來源繁多，包括以聚集體、錯(cuò)誤折疊構(gòu)象，或是以完全變性結(jié)構(gòu)形式存在的生物分子。因此，用于保證和控制質(zhì)量并提供預(yù)配方和配方必要數(shù)據(jù)所需的分析技術(shù)與制藥業(yè)中的用于小分子藥物的分析技術(shù)完全不同。這種復(fù)雜性和多變性，不僅給制造商，同樣也給監(jiān)管機(jī)構(gòu)帶來了許多新的挑戰(zhàn)。

 

挑選合適的候選分子會(huì)在其它分析中涉及各種物理化學(xué)測試過程，以排除那些有可能成為下游“問題分子”的分子。其中一個(gè)需要回答的最重要的問題是，這些分子將會(huì)在配方中有怎樣的表現(xiàn)。而值得關(guān)注的重要領(lǐng)域是蛋白質(zhì)聚集體，以及聚集可能引發(fā)的免疫反應(yīng)。監(jiān)管機(jī)構(gòu)已經(jīng)明確表達(dá)了對(duì)直徑為0.2微米至2微米的蛋白質(zhì)聚集體造成的潛在免疫原性的關(guān)注，但現(xiàn)有的粒徑測定技術(shù)，尚不足以提供這一范圍的量化數(shù)據(jù)。它們可以讓你知道有這種粒徑的粒子存在，但無法確定存在的數(shù)量。被應(yīng)用于馬爾文阿基米德系統(tǒng)的諧振質(zhì)量測定（RMM ）技術(shù)能彌補(bǔ)這一缺陷，因?yàn)樗粌H可以進(jìn)行粒徑測量，更重要的是能對(duì)直徑為50納米 - 5微米的粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)。

 

 

共振質(zhì)量測量主要是依靠一個(gè)可以檢測質(zhì)量變化的機(jī)械共振結(jié)構(gòu)。質(zhì)量增加或減少，可以使結(jié)構(gòu)的共振頻率上升或下降。由于可對(duì)頻率進(jìn)行非常精確的測定，這就為測量質(zhì)量提供了基礎(chǔ)。為了測量懸浮在液體上的微小顆粒的質(zhì)量，共振器內(nèi)置了微流體通道。當(dāng)懸浮顆粒通過該結(jié)構(gòu)時(shí)，它會(huì)改變共振器的整體質(zhì)量，由此改變其共振頻率。如圖1所示，顆粒在位置1時(shí)進(jìn)入共振器。當(dāng)顆粒到達(dá)共振器末端的位置2時(shí)，對(duì)共振頻率造成的偏移達(dá)到最大值。而當(dāng)顆粒在位置3退出時(shí)，共振頻率又恢復(fù)到基準(zhǔn)線。

 

通過測量共振頻率對(duì)基準(zhǔn)線的偏移，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)粒子質(zhì)量的測量。對(duì)于具有上浮力的微粒，如油滴（見下文），則可以觀測到相反的效果，共振頻率會(huì)相對(duì)于基準(zhǔn)線發(fā)生正偏移。

 

采用共振質(zhì)譜測量非常小的顆粒，需要使用自身質(zhì)量很小的共振器。在馬爾文阿基米德系統(tǒng)中，MEMS（微機(jī)電系統(tǒng)）傳感器能滿足這一要求。每個(gè)傳感器芯片包括一個(gè)微流體網(wǎng)絡(luò)和一個(gè)微小的懸臂，以一個(gè)特定的頻率發(fā)生共振。懸臂中內(nèi)置一個(gè)微流體通道。當(dāng)儀器中的流體系統(tǒng)將樣品推送經(jīng)過通道時(shí)，懸臂的共振頻率會(huì)發(fā)生變化。共振頻率的變化通過激光測量，先聚焦到懸臂的頂端，然后將其發(fā)送到一個(gè)分離光電二極管探測器。

 

每個(gè)粒子穿過傳感器都會(huì)引起一次共振頻率的變化，從而得到對(duì)樣品中單個(gè)顆粒浮力質(zhì)量精準(zhǔn)的測量，無論這個(gè)數(shù)據(jù)是正是負(fù)。通過這樣的測量，可以計(jì)算出粒子的質(zhì)量、粒徑（等效球）以及表面積。同時(shí)也可對(duì)樣品濃度、密度、體積和多分散性進(jìn)行整體測量。

 

 

起初，蛋白質(zhì)聚集體處于二聚體水平，此后直徑一路攀升到數(shù)十微米，高于這一范圍上部的聚集體通常采用流量式顯微鏡來測量。共振質(zhì)量測量可應(yīng)用于低于流式顯微鏡測量范圍的領(lǐng)域，包括那些粒徑在亞微米至幾微米、以及不易通過其他方法評(píng)估定量評(píng)估測量的粒徑。這也是免疫原性的影響之處，以及新的監(jiān)管要求關(guān)注的地方。

 

圖3（a）為 4 µL配制緩沖液中，亞微米級(jí)IgG蛋白聚集體的粒度分布狀況。

 

使用RMM測量得出，粒徑大于300納米的聚集體濃度為每毫升4×10⁶。因?yàn)闇y量是基于質(zhì)量的，粒度分布可以用形成每種聚集體（圖3（b））的蛋白質(zhì)分子（已知質(zhì)量的）數(shù)量來表示。圖3（c）中列出的是，提高剪切應(yīng)力一段時(shí)間后，對(duì)蛋白質(zhì)樣品的測量結(jié)果，并圖示出了在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，從300nm到1μm范圍內(nèi)聚集體的濃度在增長。這種尺寸的聚集體出現(xiàn)10倍的增加，大致對(duì)應(yīng)一條聚集體級(jí)聯(lián)，而亞微米聚集體的濃度與壓力下制劑質(zhì)量的不好有關(guān)。

 

 

蛋白質(zhì)制劑分析中另一個(gè)流行的課題是硅油，它通常作為潤滑劑，存在于盛制劑的注射器和容器中。硅油常常會(huì)混入制劑中，形成與聚集體大小接近的油滴。但主要問題不是生物相容性，因?yàn)楣栌偷瓮ǔ１徽J(rèn)為是安全的。更大的問題在于，在某些測量方法中，油滴會(huì)被誤認(rèn)為是蛋白聚集體，因此有可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

 

RMM可以通過浮力測量將硅油滴與蛋白質(zhì)聚集體區(qū)分開來。例如，在圖4中，密度大于懸浮緩沖液的聚集體，是用頻率軌跡中的負(fù)峰值來表示。

 

硅油滴的密度一般比緩沖液的密度低，會(huì)在頻率軌跡上形成正峰值，這是因?yàn)樗鼈兊拇嬖诮档土藗鞲衅鞯恼w質(zhì)量，從而提高傳感器的共振頻率。每一組都提供了單獨(dú)的分布情況。

 

 

常規(guī)分析儀器使用過程中， RMM技術(shù)應(yīng)用和推行成功至為關(guān)鍵的原因，在于它解決了蛋白質(zhì)聚集測量中的關(guān)鍵粒度范圍這一問題。同樣重要的是，在處理小劑量貴重材料時(shí)，只需100 μL粘度達(dá)到100 cP的樣品，且無需進(jìn)行樣品制備，即可進(jìn)行測量。

 

由于能對(duì)50納米至5微米尺寸范圍內(nèi)的顆粒進(jìn)行檢測并精確計(jì)數(shù)，以及對(duì)浮力質(zhì)量、干質(zhì)量和大小進(jìn)行可靠測量，共振質(zhì)譜測量成為蛋白特性鑒定極具吸引力的方案。有關(guān)配方和穩(wěn)定性的定量信息，可被轉(zhuǎn)化為對(duì)效能及其穩(wěn)定性的信息。目前，RMM已經(jīng)被用于生物制劑早期開發(fā)階段，對(duì)聚集體進(jìn)行檢測和量化，這實(shí)現(xiàn)了“發(fā)現(xiàn)越早，代價(jià)越小”的理念。

 

 

 

 

在傳統(tǒng)模式下，要將一種分析儀器推向市場，并使其成為完善的最終產(chǎn)品，往往要耗時(shí)數(shù)年。但這種模式卻完全不適用于生物制藥部門，因?yàn)樗荒芑卮饡r(shí)過境遷的問題。處于生物制藥研究最前沿的研究人員，需要能解決當(dāng)前問題的分析工具；而對(duì)供應(yīng)商的挑戰(zhàn)，則在于需要對(duì)未知領(lǐng)域進(jìn)行預(yù)測，在這些領(lǐng)域，快速變化的分析和監(jiān)管要求不斷考驗(yàn)相關(guān)參與者。因此有必要了解什么是可以測量的，什么樣的測量結(jié)果可以提供質(zhì)量方面的有價(jià)預(yù)測信息，并預(yù)見未來所需要的測量。

 

馬爾文通過創(chuàng)建生物科學(xué)開發(fā)計(jì)劃，助力生物科學(xué)行業(yè)的飛速發(fā)展。該計(jì)劃旨在跟上生物制藥技術(shù)快速的發(fā)展步伐，并肩負(fù)起作為分析儀器制造商的責(zé)任，即針對(duì)迅速發(fā)展的分析和監(jiān)管挑戰(zhàn)，快速提供令人信服的解決方案。獲得成功的關(guān)鍵是以高度自信、開放的態(tài)度，展開高層次技術(shù)開發(fā)合作，并建立靈活的技術(shù)和產(chǎn)品開發(fā)流程，對(duì)確認(rèn)的分析需求保持絕對(duì)的專注。

 

盡管生物科學(xué)開發(fā)計(jì)劃是馬爾文組織機(jī)構(gòu)的一個(gè)組成部分，其運(yùn)營卻是在華盛頓特區(qū)附近的工廠中開展。該計(jì)劃由馬爾文公司首席技術(shù)官E Neil Lewis 博士負(fù)責(zé)，他領(lǐng)導(dǎo)著一支由科學(xué)家、工程師和業(yè)務(wù)開發(fā)人員組成的專家小組。這些成員雖然分處各地，卻又緊密聯(lián)系于馬爾文核心團(tuán)隊(duì)之中。他們專注于生物制藥行業(yè)的要求，尤其是有關(guān)配方和產(chǎn)品開發(fā)的生物化學(xué)和生物物理表征的需求。

 

這一對(duì)市場反應(yīng)迅速、經(jīng)費(fèi)充足且目標(biāo)明確的計(jì)劃，將會(huì)促進(jìn)生物制藥企業(yè)、技術(shù)創(chuàng)新者和領(lǐng)先學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)之間的密切合作。通過建立這種互惠互利的關(guān)系，馬爾文可以實(shí)時(shí)了解新興產(chǎn)業(yè)的要求，并作出快速響應(yīng)，生物制藥部門則可以盡早介入，并幫助設(shè)計(jì)它所亟需的前沿技術(shù)。該項(xiàng)合作的第一項(xiàng)成果，是達(dá)成了將馬爾文阿基米德系統(tǒng)推向市場的協(xié)議。隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，今年會(huì)有完全成熟的產(chǎn)品推出。

 

欲了解有關(guān)馬爾文生物科學(xué)發(fā)展計(jì)劃的進(jìn)一步信息，敬請(qǐng)聯(lián)系E. Neil Lewis博士

 

圖1：在流體中測量粒子質(zhì)量

 

圖2：共振質(zhì)譜測量儀器的配置（馬爾文阿基米德系統(tǒng)）

 

圖3：（自左至右）（a），（b）及（c）：利用馬爾文阿基米德系統(tǒng)進(jìn)行聚集體檢測

 

圖4：區(qū)分蛋白質(zhì)聚集體和受污染硅油液滴能力的展示