立體顯微鏡通常被稱為實驗室或生產部門的主力。選擇立體顯微鏡時，需要考慮哪些因素呢？ 答案是：“看情況”。這是為什么呢? 因為它取決于用途，取決于用戶想要完成的任務。立體顯微鏡基本上是一種工具，用于將三維目標在三個維度中放大。 不同于復式顯微鏡，立體顯微鏡能夠應付這個任務。

背景知識

格里諾和 Cycloptic®原理

過去的雙目顯微鏡，其特點是透鏡系統(tǒng)簡單，而且設計和傳統(tǒng)的復式顯微鏡相同。 此類解剖顯微鏡，正如當時所熟知的那樣，主要用于生物學中的解剖用途；當時沒有技術上的應用。大約在 1890 年，美國生物學家和動物學家霍雷肖•S•格里諾（Horatio S. Greenough）采用了一項設計原理，今天仍為光學儀器的所有主要制造商所使用?！案窭镏Z原理”基礎上的立體顯微鏡，實現(xiàn)了真正的高質量立體圖像。

1957 年，美國光學公司采用了帶有共用主物鏡的現(xiàn)代立體顯微鏡設計，并命名為Cycloptic®。它的現(xiàn)代鋁外殼下，是兩道平行的光束的路徑和主物鏡，以及一個五步變倍器。此種立體顯微鏡，制造商除采用格里諾原理外，還采用望遠鏡或 CMO（普通主物鏡）原理，并用于模塊化的、高性能的儀器。兩年后，另一家美國公司博士倫提出了 StereoZoom® 格里諾設計，作出了開創(chuàng)性的創(chuàng)新： 一步到位的變倍器（變焦）。 今天幾乎所有的設計都是基于一個變焦系統(tǒng)。

（左）：Cycloptic®，基于望遠鏡原理的第一臺立體顯微鏡圖 2a、b （右）：立體顯微鏡的兩種基本原理。a：望遠鏡或 CMO 原理 b：格里諾原理。

立體顯微鏡的選擇標準

時至今日，立體顯微鏡仍基于提到的技術方法——格里諾或 CMO 原理。

四個事項需要仔細評估：

a）用途是什么？
b）哪種結構需要觀察、記錄或可視化？
c）有多少人在使用顯微鏡？
d）解決方案的可用預算是多少？

一旦上述因素已知，則可以歸結為以下標準。

放大倍數(shù)、變焦范圍和物場

景深和數(shù)值孔徑

光學質量和工作距離

人體工學

照明

放大倍數(shù)、變焦范圍和物場

立體顯微鏡的總放大倍數(shù)，是變倍器、物鏡和目鏡的放大倍數(shù)的組合。

變倍器或變焦體

像放大鏡一樣，變倍器由光學透鏡構成，可以用來改變儀器的放大倍數(shù)。改變變倍器的位置，會改變圖像放大的程度。圖像放大的程度稱為放大倍數(shù)。現(xiàn)代立體顯微鏡能夠提供 16 倍放大（只有變焦體），20.5:1 的變焦范圍，其特點是能夠進行可靠測量的機動化或編碼。

接下來，圖像通過目鏡得到進一步放大。為找出目鏡中觀察到的目標的放大程度，用戶必須將變倍器和目鏡的放大倍數(shù)相乘。

然而為了保證完整性，提供公式如下：

MTOT VIS 為我們要計算的放大倍數(shù)。 VIS 代表“視覺”。

z 是變倍器的等級。

ME 為目鏡的放大倍數(shù)。
MO 為主物鏡的放大倍數(shù)（當格里諾系統(tǒng)中未使用輔助透鏡時為 1 倍）

物場

當從適當?shù)木嚯x向目鏡中觀察、而且瞳孔間距設置正確時，可以看到稱為物場的一個圓形區(qū)域。 物場的直徑根據放大倍數(shù)而變化。換言之，放大倍數(shù)和物場直徑之間存在著數(shù)學關系。 10 倍目鏡提供的物場數(shù)是23。這意味著變焦體和主物鏡放大 1 倍時，物場大小為23mm。 3 倍放大時物場減少到三分之一，即物場的直徑僅有7.66mm。

景深和數(shù)值孔徑

在顯微鏡中，景深往往被視為一種經驗參數(shù)。 實際上它是由數(shù)值孔徑、分辨率和放大倍數(shù)之間的相關性確定的。為了得到最佳視覺印象，現(xiàn)代顯微鏡的調整設施會在景深和分辨率——在理論上具有負相關性的兩個參數(shù)——之間產生一種最佳平衡。

視覺景深的實際價值

在視感景深這個問題上，Max Berek 是第一位發(fā)表觀點的作者，早在 1927 年他就發(fā)表了經過大量實驗得來的結果。Berek 公式給出了視覺景深的實際值，因此今天仍然使用。

其簡化形式如下：

TVIS：視感景深

n：目標位于其上的介質的折射率。 如果目標被移開，則在公式中輸入介質的折射率，該介質形成變化的工作距離。

λ：使用的光的波長，對白光來說，λ = 0.55μm

NA：目標一側的數(shù)值孔徑

MTOT VIS：顯微鏡的視覺總放大倍數(shù)

如果以上方程中，視覺總放大倍數(shù)為有效放大倍數(shù)所取代（MTOTVIS = 500 - 1000 x NA），則可以看出，景深的第一個近似值與數(shù)值孔徑的平方成反比。

特別是放大倍數(shù)較低時，景深可以通過縮小鏡頭光圈（即減少數(shù)值孔徑）顯著增加。 這通常是通過光圈或一共軛平面上的光圈完成的。然而，數(shù)值孔徑越小時，橫向分辨率就越低。

因此問題是找到分辨率與景深（取決于目標結構）之間的最佳平衡。在立體顯微鏡中，為了更高的景深，常常需要做出一定的妥協(xié)，因為三維結構的 z 值經常有此要求。

帶景深的格里諾立體顯微鏡的目標平面

更多景深——FusionOpticsTM

FusionOptics™是一種復雜的光學方法，能夠消除立體顯微鏡中分辨率和景深之間的關系。在這里，光路之一為觀察者的一只眼睛提供了高分辨率和低景深的一副圖像。通過第二光路，另一只眼睛看到相同目標的低分辨率和高景深的圖像。人類大腦會將兩個獨立的圖像組合成一個最佳整體圖像，其特點是分辨率高和景深高。

另一個說明人類大腦非凡能力的例子是格里諾立體顯微鏡。在這里，左右光路的目標平面彼此形成一個微小的角度。在整體圖像中，產生的整個區(qū)域似乎顯得清晰,盡管左邊或右邊的圖像并非如此。

現(xiàn)代立體顯微鏡，其特點是 20.5:1 變焦范圍、APO 校正光學系統(tǒng)和 FusionOptics™。

光學質量

立體顯微鏡的光學質量通常列為 Achro 或 Achromat（消色差），以及 Apo（復消色差），代表球形和色差的最高程度的校正。場曲率校正縮寫為 Plan，而 PlanApo 是色差和場曲率校正的組合。

Achro, Achromat：消色差校正

Plan：平場光學校正

PlanApo：復消色差和平場校正

色差是什么?

在立體顯微鏡等光學儀器中，色差是一種失真，鏡頭無法將所有顏色集中到同一個會聚點。這是因為鏡頭對不同波長的光有不同的折射率(透鏡的色散)。折射率隨著波長的增加而減少。良好的光學設計的目的，是減少或完全消除此種影響。

消色差透鏡是一種旨在限制色差和球面像差的影響的透鏡。消色差透鏡經過校正后，將兩種波長（通常為紅色和藍色）聚焦到同一個平面上。此類透鏡或顯微鏡用于以下任務，即無需顏色復現(xiàn)和主要是評估幾何特性。另一方面，復消色差透鏡旨在較正三種波長（紅、綠和藍色），將它們聚焦到同一個平面上。工作距離

這是標本聚焦時，物鏡前鏡頭和和標本頂部之間的距離。在大多數(shù)情況下，物鏡的工作距離隨著放大倍數(shù)增加而減少。在立體顯微鏡中，工作距離是最重要的標準之一，因為它直接影響著顯微鏡作為工具的可用性。

人體工學鏡筒——身體和頭部放松，手臂有舒適支撐，腿部有足夠空間，并充分利用椅子。

人體工學——千人千樣

人有高有矮，這使得儀器需求成為個人問題。例如，為一定的任務配備的顯微鏡，有配件和特定的工作距離，其現(xiàn)有高度可能相當不適合特定的用戶。如果觀察高度過低，觀察者在工作時將被迫向前彎曲，導致頸部肌肉緊張。因此在理想狀態(tài)下，顯微鏡的觀察高度和視角，應根據用戶的體形調整。此外，可變的觀察高度，是用來防止完全久坐不動的姿勢的最佳方法。它允許觀察者采用個人坐姿，并按照自然的沖動周期性地改變，以便不時左右移位。的確，椅子的高度可以改變，這樣一種放松、微微彎曲的姿勢代替了之前的正襟危坐，但這不是最佳方法。更簡單、更舒適的方法是使用一種可變的雙目鏡筒，以彌補身高的差異。

由于采用了模塊化產品的方法，帶有 CMO 設計的立體顯微鏡可以根據用戶的尺碼或工作習慣提供的多種方式定制儀器，因而是首選方案。

照 明

在立體顯微鏡中，照明是將所有的工作暴露在光線下的關鍵。正確的照明將僅僅通過改變光的類型，便使所需的結構可視化，或有關樣品的新信息被發(fā)現(xiàn)。重要的是，將照明正確地匹配到正確的顯微鏡和正確的用途上。

現(xiàn)代立體顯微鏡照明系統(tǒng)基于持久的發(fā)光二極管，并提供獨特的方式，將解決方案整合到整個顯微鏡系統(tǒng)。高度整合的環(huán)形光源和使用中的偏振器，是為了減少標本上的眩光。

照明類型

入射

入射光主要用于不透明的標本。此種光（環(huán)形光、射燈等）的實現(xiàn)方法將取決于標本紋理和使用需求。入射光為各種各樣不透明的標本所需要。根據標本紋理和結果目標，入射照明方案的一種折衷選擇是可用的。

透射光

透射光對于各種透明標本很理想，范圍從生物樣品（如生物模型）到聚合物。

標準透射明視野照明

標準透射明視野照明用于所有類型的透明標本，其具有高對比度和足夠的顏色信

斜透射照明

此種照明技術用于幾乎透明、無色的標本。由于照明的斜位置，可以實現(xiàn)標本更大的對比度和視覺清晰度。

暗視場照明

立體顯微鏡中的暗視場觀察，需要一個包括反射鏡和遮光板的特制的臺子，以便將一個倒置的照明空心錐體以傾斜角度向標本方向移動。暗視場照明的原理要素，對于立體顯微鏡和更傳統(tǒng)的復式顯微鏡是相同的，通常配有復雜的多鏡頭聚光鏡系統(tǒng)、或帶有特制內鏡的聚光鏡，該內鏡包含調整為特定幾何形狀的反射面。

清晰、透明標本的對比方法

Rottermann Contrast™ 是一種局部照明技術,其顯示亮度不同時折射率的改變。相位結構通常在正地形對比中表現(xiàn)為立體的、浮雕式的圖像（如山丘），而在倒轉地形對比中表現(xiàn)為凹進。此種技術提供了許多變量視圖，以此提取最大可能的信息量。

結 論