在自然界中存在大量豐富的微生物資源，但目前被人們所培養(yǎng)利用的僅僅占1%～10%，還有大量的微生物沒(méi)有被人們所了解和利用。隨著基因組學(xué)在生物技術(shù)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，微生物基因組學(xué)的研究憑借基因組研究(TIGR)所利用鳥槍法成功地對(duì)流感嗜血菌(Haem ophilus influenzae)的全基因組序列的測(cè)定而日趨發(fā)展起來(lái)。特別通過(guò)將分子生物學(xué)的研究方法與微生物學(xué)的研究相結(jié)合，使得人們?cè)谖⑸锏倪M(jìn)化、結(jié)構(gòu)以及基因組等方面取得了一系列重要的研究成果，從而使大量未培養(yǎng)的微生物的利用變?yōu)榭赡?，其中變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)在對(duì)微生物多樣性的研究中應(yīng)用廣泛，目前DGGE已被應(yīng)用于分析自然環(huán)境中細(xì)菌、古菌、真核生物、微型真核生物和病毒群落的生物多樣性。這一技術(shù)能夠提供群落中優(yōu)勢(shì)種類信息且同時(shí)分析多個(gè)樣品，具有可重復(fù)和容易操作等特點(diǎn)。適合于調(diào)查種群的時(shí)空變化，并且可通過(guò)對(duì)切下的帶進(jìn)行序列分析或與特異性探針雜交分析來(lái)鑒定群落成員。
1 DGGE的基本原理
圖1 DGGE反應(yīng)原理
為了提高DGGE的檢測(cè)敏感性，通常在一側(cè)引物的5′端設(shè)計(jì)增加一段富含GC的區(qū)域( GC-Clamp，其長(zhǎng)度通常為30～50個(gè)核苷酸) ，避免了DNA的完全解鏈，從而提高了不同堿基的檢出率，使相差一個(gè)堿基的序列也能分辨分離。
2 技術(shù)步驟
該技術(shù)主要操作過(guò)程如下：(1)樣品總DNA提取;(2)樣品16SrDNA片段的PCR擴(kuò)增;(3)DGGE條件優(yōu)化與分析;(4)割膠測(cè)序等后續(xù)處理。
3 DGGE 的應(yīng)用前景
自Handelsman 等1998 年提出元基因組學(xué)(環(huán)境基因組，Metagenomics)后，利用現(xiàn)代基因組技術(shù)進(jìn)行自然或人工環(huán)境的微生物群落的研究成為熱門方向。目前，元基因組學(xué)手段已經(jīng)被應(yīng)用于海洋和土壤微生物群落的研究。來(lái)源于環(huán)境中未培養(yǎng)微生物的功能基因甚至是基因組學(xué)研究拓寬了微生物群落的研究領(lǐng)域。DGGE 技術(shù)可以監(jiān)測(cè)復(fù)雜環(huán)境中特異的功能基因及其表達(dá)研究,為元基因組學(xué)研究提供有利信息和基因篩選方案。此外DGGE 分析中獲得的核酸序列還可以進(jìn)一步應(yīng)用于熒光原位雜交、DNA 芯片和實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time PCR) 等技術(shù)，為特異種群的快速檢測(cè)做出貢獻(xiàn)。
目前DGGE 在環(huán)境微生物學(xué)中是一種被普遍接受的進(jìn)行微生物群落復(fù)雜性和行為研究的分子生物學(xué)工具。該技術(shù)具有可靠、可重復(fù)、快速和容易操作等特點(diǎn)。結(jié)合PCR 擴(kuò)增標(biāo)記基因或其轉(zhuǎn)錄物(rRNA 和mRNA)的DGGE 能直接顯示微生物群落中優(yōu)勢(shì)組成成分。由于它可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行分析使之非常適合調(diào)查微生物群落的時(shí)空變化, 而且可能通過(guò)序列分析切下的帶或通過(guò)與獨(dú)特的探針雜交鑒定群落成員。加之對(duì)這種技術(shù)作用的理論背景有很好的了解, 如雙鏈DNA 在溶液中的解鏈行為的熱動(dòng)力學(xué)原理。使用DGGE 可以了解環(huán)境被干擾后微生物群落或某種指示微生物的命運(yùn)。功能基因作為分子標(biāo)記的常規(guī)使用能夠用來(lái)鑒別密切相關(guān)但生態(tài)上不同的種群。末端標(biāo)記的熒光PCR 產(chǎn)物和(區(qū)內(nèi)(intra-lane) 標(biāo)準(zhǔn)可用于檢測(cè)稀少群落成員和便于樣品與樣品之間的精確比較。雙梯度(結(jié)合聚丙烯酰胺梯度與變性劑梯度)DGGE分析能獲得更好的分辨率。為減少各種不同技術(shù)的偏見(jiàn)和限制性, 結(jié)合PCR-DGGE 和其它分子生物學(xué)技術(shù)及微生物學(xué)方法將更實(shí)際地揭示微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能。
盡管DGGE 電泳技術(shù)在研究群落動(dòng)態(tài)和多樣性方面存在很多優(yōu)勢(shì)，但是該技術(shù)無(wú)法給出代謝活性、細(xì)菌數(shù)量和基因表達(dá)水平方面的信息。因此必須與其它技術(shù)相結(jié)合才能彌補(bǔ)不足。Biolog和酶學(xué)分析均可以提供群落代謝活性特征。此外熒光原位雜交技術(shù)可以提供細(xì)菌的相對(duì)數(shù)量信息，穩(wěn)定同位素探針的原位雜交技術(shù)，可以提供代謝信息，得到群落結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系。通過(guò)16S rDNA或基因文庫(kù)也是分析不同種群的相對(duì)數(shù)量的一種方法。利用Real-time PCR 擴(kuò)增特異種屬的16S rRNA或功能基因，可以對(duì)群落的細(xì)菌數(shù)量和基因表達(dá)水平進(jìn)行定量。因此，與其他分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合后，可以進(jìn)一步發(fā)揮DGGE 技術(shù)的效能，更好的為微生物群落結(jié)構(gòu)和功能分析服務(wù)。（文章來(lái)源：
