Stem-loop實時定量RT PCR
傳統(tǒng)實時定量RT PCR只能檢測到miRNA前體，而Stem-loop實時定量RT PCR技術(shù)可以解決這一問題。Stem loop實時定量RT PCR是一項高特異度、敏感度的檢測miRNA表達的實驗技術(shù)，包括設(shè)計具有莖環(huán)（stem loop）結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物和用miRNA熒光標(biāo)記的特異分子探針進行實時PCR 二個關(guān)鍵步驟。該技術(shù)具有以下優(yōu)點:高度特異性，對序列高度同源的miRNA也可精確區(qū)分；超寬的定量線性范圍和高度的檢測靈敏度；樣品消耗少，僅需1～10 ng的總RNA；適用范圍廣，總RNA、細胞裂解物以及純化的RNA都可用于miRNA的定量檢測。
Stem-loop實時定量RT PCR基本原理： microRNA的RT-PCR一般使用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，這種具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物針對所需檢測的目的microRNA設(shè)計，具有特異的序列，結(jié)構(gòu)示意圖如下所示。內(nèi)參使用的是小RNA U6，U6的反轉(zhuǎn)錄使用的是隨機引物。將反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物作為real-time PCR的模板，檢測目的microRNA的引物是針對目的microRNA的特異的上下游引物，檢測內(nèi)參使用的是針對U6的特異的上下游引物。
實驗過程
1、用Trizol抽提t(yī)otal RNA，抽提方法同普通的RNA的Trizol抽提，只是在用異丙醇處理時需要4℃ 過夜。將抽提得到的RNA置于-80℃保存。
2、將抽提的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄的體系一般使用12.5ul的體系。具體的體系如下：
A: RNase free water
B: Total RNA: 0.625ug
C: Impron buffer: 2.5ul
D: dNTPs: 2.5ul
E: RNase inhibitor: 0.625ul
F: Impron Mgcl2: 1.5ul
G: Primer: 0.5ul
H：Reverse transcriptase: 0.625ul
具體的操作是事先計算好需要的模板量，以及所要的RNase free water的量，在PCR小管中加好需要的模板量以及RNase free water的量，并將剩下的模板立即置于－80℃保存。再按照反轉(zhuǎn)錄的體系做好總的MIX，再分裝到每個PCR小管內(nèi)。將PCR小管置于PCR儀上反轉(zhuǎn)，反轉(zhuǎn)的具體程序如下： 25℃ 5 min ,42℃ 60 min ,70℃ 15 min. 4℃儲藏
3、 反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為real-time PCR檢測的模板，由于real-time PCR檢測靈敏性，要求每個樣需要三個重復(fù)。每一個反應(yīng)的用量如下：
1. SYBR 5.0ul
2. Primer mix 0.2ul
3. cDNA 1.0ul
4. water 3.8ul
4、在八連管中先加入模板，加入3.4ul的cDNA模板。
5、 根據(jù)需要檢測樣本的個數(shù)，計算所需要的SYBR、Primer mix、water量，具體的計算過程為：試劑單反應(yīng)量X檢測樣本個數(shù)X3.4 ,根據(jù)計算需要的量制作MIX 。將MIX加入每個八連管的小管中。
6、 將對應(yīng)的每個八連管的小管取出10ul加入96孔板，每個小管對應(yīng)96孔板的3個孔，即3個重復(fù)孔。
7、 加完樣品后，用專用的封膜覆蓋96孔板，用專用的刮板覆蓋嚴(yán)實。
8、上機檢測。具體PCR程序如下：
1：50℃ 2 min ;
2：95℃ 5 min ;
3：95℃ 30 s ;
4：60℃ 40 s ;
5：72℃ 30 s ;
6：95℃ 15 s ; 60℃ 30s ;95℃ 15 s .</OL< ol>
實驗注意事項
1、由于real-time PCR的檢測十分靈敏，因此它對RNA定量的準(zhǔn)確性要求較高，一般RNA的定量多采用3復(fù)孔定量。
2、 無論在反轉(zhuǎn)錄或real-time PCR加樣時要求加樣一定要準(zhǔn)確。
3、 在將八連管的mix加入96孔板前一定要充分混勻，一般采取的策略是將八連管一剪為二，置于Vortex上振蕩混勻，Vortex的轉(zhuǎn)速不要太高，以免將管內(nèi)的液體濺到蓋子內(nèi)。
miRNA靶基因的鑒定
目前鑒定靶基因最直接的方法是, 利用熒光定量PCR及Western blot方法分別檢測轉(zhuǎn)染或敲低miRNA后細胞中mRNA水平及蛋白水平的變化, 從而確定miRNA與靶基因的對應(yīng)關(guān)系. 這種方法可以大大提高準(zhǔn)確率，但最終確定靶基因，還需要鑒定miRNA的靶位點. 而miRNA的靶位點的鑒定最常用的方法是熒光素酶報告基因法. 其基本原理是首先構(gòu)建熒光素酶表達載體, 將希望鑒定的miRNA靶基因的3?UTR構(gòu)建到熒光素酶基因的3’UTR中, 然后將熒光素酶基因表達載體轉(zhuǎn)染細胞并改變細胞中相應(yīng)miRNA的表達水平, 最后檢測熒光素酶的表達情況以分析轉(zhuǎn)染3’UTR中是否含有miRNA的靶位點。
