X射線晶體衍射技術(shù)(X-RAY CRYSTALLOGRAPHY)即將成為歷史，低溫電子顯微技術(shù)(CRYO-ELECTRON MICROSCOPY)引起了揭示細(xì)胞內(nèi)隱秘機(jī)制的革命。

　　在劍橋大學(xué)一幢建筑的地下室里，一場(chǎng)技術(shù)革命正在醞釀。

　　一個(gè)笨重的、大約3米高的金屬盒子通過連接細(xì)胞的橙色纜線，安安靜靜地傳輸著以萬(wàn)億字節(jié)計(jì)算的數(shù)據(jù)。這是世界上最先進(jìn)的低溫電子顯微鏡之一：低溫電子顯微鏡通過電子束對(duì)冷凍的生物分子進(jìn)行成像，從而得到分子的三維結(jié)構(gòu)。站在這個(gè)耗資770萬(wàn)美金的儀器旁，英國(guó)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(UK Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, LMB)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家 Sjors Scheres表示，低溫電子顯微鏡非常敏感，一聲喊叫就會(huì)帶來(lái)極大誤差，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。“英國(guó)需要更多低溫電子顯微鏡，因?yàn)槲磥?lái)它會(huì)成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的主流。”

　　低溫電子顯微鏡震驚了結(jié)構(gòu)生物學(xué)。過去30年里，低溫電子顯微鏡揭示了核糖體、膜蛋白和其它關(guān)鍵細(xì)胞蛋白的精細(xì)結(jié)構(gòu)。這些發(fā)現(xiàn)都發(fā)表在頂級(jí)雜志上。結(jié)構(gòu)生物學(xué)家們表示，毫不夸張地說(shuō)，低溫電子顯微技術(shù)正處于革命之中：低溫電子顯微鏡能夠快速生成高分辨率的分子模型，這一點(diǎn)遠(yuǎn)超X射線晶體衍射等方法。依靠舊方法獲得諾獎(jiǎng)的實(shí)驗(yàn)室也在努力學(xué)習(xí)這一技術(shù)。這種新模型能夠準(zhǔn)確地揭示細(xì)胞運(yùn)行的必要機(jī)制，以及如何靶向針對(duì)疾病相關(guān)的蛋白。

　　“低溫電子顯微鏡能夠解決很多以前無(wú)法解決的謎題。”舊金山加利福利亞大學(xué)(University of California)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家David Agard這樣說(shuō)道。

　　幾年前Scheres被招進(jìn)LMB，任務(wù)是幫助改進(jìn)低溫電子顯微鏡，最終他成功了。上個(gè)月，他們發(fā)表了這個(gè)領(lǐng)域最令人振奮的成就：阿茲海默癥相關(guān)的酶的高清圖片，圖片包括該酶的1200左右個(gè)氨基酸，分辨率達(dá)到零點(diǎn)幾納米。

　　生物學(xué)家們?nèi)缃袢栽谂Πl(fā)展該技術(shù)，以期用它解決小分子或可變形分子的精微結(jié)構(gòu)——這對(duì)低溫電子顯微鏡來(lái)說(shuō)，也是一大挑戰(zhàn)。來(lái)自加利福利亞大學(xué)(University of California)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Eva Nogales表示，叫它革命也好，飛躍也好，低溫電子顯微鏡的確打開了一扇大門。

　　蛋白結(jié)晶

　　結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域有一條不成文的觀點(diǎn)：結(jié)構(gòu)決定功能。只有知道生物分子的原子排布，研究者們才能了解這個(gè)蛋白的功能。例如，核糖體是如何根據(jù)mRNA的序列來(lái)制造蛋白，分子孔道是如何開和關(guān)的。幾十年來(lái)，分析蛋白結(jié)構(gòu)有一個(gè)無(wú)冕之王——X射線晶體衍射。在X射線晶體衍射中，科學(xué)家們讓蛋白結(jié)晶，接著利用X射線照射，隨后根據(jù)X射線的衍射來(lái)重建蛋白的結(jié)構(gòu)。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)銀行(Protein Data Bank)的100,000多條蛋白詞目里，超過90%的蛋白結(jié)構(gòu)是利用X射線晶體衍射技術(shù)解析得到的。很多諾貝爾獎(jiǎng)也與這一技術(shù)相關(guān)，例如1962年揭示DNA雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)的諾獎(jiǎng)。

　　盡管X射線晶體衍射一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)家的最佳工具，但是它有較大的限制?？茖W(xué)家們可能需要幾年才能找到把蛋白形成大塊結(jié)晶的方法。而很多基礎(chǔ)蛋白分子，例如嵌在細(xì)胞膜上的蛋白，或是形成復(fù)合體的蛋白卻無(wú)法被結(jié)晶。

　　當(dāng)Richard Henderson 1973年到LMB，研究菌視紫紅質(zhì)(一種利用光把質(zhì)子運(yùn)進(jìn)膜內(nèi)的蛋白)結(jié)構(gòu)時(shí)，X射線晶體衍射是首選工具。Henderson和他的同事Nigel Unwin成功地做出了該蛋白的二維結(jié)晶，但卻不適用于X射線衍射。因此他們決定使用電子顯微鏡。

　　當(dāng)時(shí)，電子顯微鏡主要用于研究用重金屬染過色的病毒或組織切片。一束光子打在樣本上，新生的電子被檢測(cè)到，被用于解析樣本結(jié)構(gòu)。這種方法成功制作了第一幅病毒的精微圖片——一種煙草病毒。但染色導(dǎo)致無(wú)法看清各個(gè)蛋白，更不要說(shuō)原子細(xì)節(jié)了。Agarad表示，樣本上要么滿是斑點(diǎn)，要么沒染上，你只能看到分子的輪廓。

　　Herderson等人省略了染色的步驟，把菌視紫紅質(zhì)的單層晶體放到金屬網(wǎng)格中，然后用電子顯微鏡進(jìn)行成像。Agard表示，這個(gè)過程里，你看到的是蛋白的原子。這在當(dāng)時(shí)是很大的進(jìn)步，因?yàn)楫?dāng)時(shí)人們都認(rèn)為不可能利用電子顯微鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)。Henderson等人在1975年發(fā)表了這一成果。

　　20世紀(jì)80年代和90年代，低溫電子顯微鏡領(lǐng)域發(fā)展迅速。一個(gè)關(guān)鍵性突破是利用液態(tài)乙烷來(lái)快速冷凍蛋白溶液。這也是為什么叫低溫電子顯微鏡的原因。但這個(gè)技術(shù)的分辨率僅為1納米，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到針對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的需求。而當(dāng)時(shí)X射線晶體衍射的分辨率能達(dá)到0.4納米。NIH等資助者投入了數(shù)億美金來(lái)支持蛋白晶體領(lǐng)域的發(fā)展，但對(duì)于低溫電子顯微鏡領(lǐng)域的資助卻很少。

　　1997年，Henderson參加了高登研究會(huì)議(Gordon Research Conference )關(guān)于3D電子顯微鏡的年會(huì)。一位同事以這樣的話做為開幕致詞，“低溫電子顯微鏡技術(shù)非常有限，不可能超越X射線晶體衍射。” 但Henderson的想法完全不同，在下一場(chǎng)發(fā)言中，他做出了反擊。Henderson指出，低溫電子顯微鏡會(huì)超越其它各種技術(shù)，成為全球研究蛋白結(jié)構(gòu)的主流工具。

　　革命由此開始

　　在此之后，Henderson等人致力于提高電子顯微鏡的性能——尤其是感知電子的靈敏度。在數(shù)碼相機(jī)席卷全球很多年后，很多電子顯微鏡學(xué)家仍然傾向于使用傳統(tǒng)的膠片，因?yàn)楸绕饠?shù)碼感應(yīng)器，膠片能更有效地記錄電子。與顯微鏡生產(chǎn)商合作時(shí)，研究者們發(fā)明了一種新的直接電子探測(cè)器，這種探測(cè)器的靈敏度遠(yuǎn)高于膠片和數(shù)碼相機(jī)探測(cè)器。

　　大約在2012年，這種探測(cè)器能夠以一分鐘幾十幀的高速得到單個(gè)分子原子的連續(xù)圖像。同時(shí)，和Scheres一樣的研究者們精心編寫了將多張2D圖片建成3D模型的軟件程序。這些3D圖像的畫質(zhì)可以媲美X射線晶體衍射獲得的圖像。

　　低溫電子顯微鏡適用于研究大的、穩(wěn)定的分子，這些分子能夠承受電子的轟擊，而不發(fā)生變形——由多個(gè)蛋白組成的分子機(jī)器是最好的樣本。因此由RNA緊緊圍繞的核糖體是最佳的樣本。三位化學(xué)家用X射線晶體衍射研究核糖體溶液的工作在2009年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，但這些工作花了幾十年。近幾年，低溫電鏡研究者們也陷入了“核糖體熱”。多個(gè)團(tuán)隊(duì)研究了多種生物的核糖體，包括人類核糖體的首個(gè)高清模型。X射線晶體衍射的研究成果遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于LMB的Venki Ramakrishnan實(shí)驗(yàn)室，Venki獲得了2009年的諾獎(jiǎng)。Venki表示，對(duì)于大分子來(lái)說(shuō)，低溫電子顯微鏡遠(yuǎn)比X射線晶體衍射要實(shí)用。

　　這幾年，低溫電子顯微鏡的相關(guān)文章有很多：2015年一年，這個(gè)技術(shù)就用于100多個(gè)分子的結(jié)構(gòu)研究。X-射線晶體衍射只能對(duì)單個(gè)、靜態(tài)的蛋白晶體成像，但低溫電子顯微鏡能夠?qū)Φ鞍椎亩喾N構(gòu)象進(jìn)行成像，幫助科學(xué)家們推斷蛋白的功能。

　　5月，多倫多大學(xué)(University of Toronto)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家John Rubinstein等人使用了100,000張低溫電子顯微鏡圖片來(lái)生成V-ATPase 的“分子電影”，V-ATPase的作用是消耗ATP，把質(zhì)子運(yùn)進(jìn)運(yùn)出細(xì)胞液泡。”我們發(fā)現(xiàn)，這個(gè)酶非常靈活，可以彎折、扭曲和變型。” Rubinstein說(shuō)道。他認(rèn)為，這是由于這個(gè)酶的靈活性，它能夠高效地把ATP 釋放的能量傳遞到質(zhì)子泵。

　　2013年Nogales的團(tuán)隊(duì)拼接了調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。他們發(fā)現(xiàn)，復(fù)合體的一個(gè)臂上懸掛著緊繞DNA鏈的10納米結(jié)構(gòu)，這段結(jié)構(gòu)可能影響基因轉(zhuǎn)錄。Nogales表示，這個(gè)結(jié)構(gòu)很漂亮，它可以幫助我們分析這個(gè)分子起作用的機(jī)制。

　　小而漂亮

　　現(xiàn)在低溫電鏡迅猛發(fā)展，專家們正在尋找更大的挑戰(zhàn)作為下一個(gè)解析目標(biāo)。對(duì)很多人來(lái)說(shuō)，最想解析的是夾在細(xì)胞膜內(nèi)的蛋白。這些蛋白是細(xì)胞信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，也是比較熱門的藥物靶標(biāo)。這些蛋白很難結(jié)晶，而低溫電子顯微鏡不大可能對(duì)單個(gè)蛋白進(jìn)行成像，這是因?yàn)楹茈y從背景噪音中提取這些信號(hào)。

　　這些困難都無(wú)法阻擋加利福利亞大學(xué)(University of California)的生物物理學(xué)家程亦凡。他計(jì)劃解析一種細(xì)小的膜蛋白TRPV1。TRPV1是檢測(cè)辣椒中引起灼燒感的物質(zhì)的受體，并與其它痛感蛋白緊密相關(guān)。加利福利亞大學(xué)病理學(xué)家David Julius等人之前嘗試結(jié)晶TRPV1，結(jié)果失敗。用低溫電子顯微鏡解析TRPV1項(xiàng)目，一開始進(jìn)展緩慢。但2013年底，技術(shù)進(jìn)步使得這一項(xiàng)目有了重大突破，他們獲得了分辨率為0.34納米的TRPV1蛋白的結(jié)構(gòu)。該成果的發(fā)表對(duì)于領(lǐng)域來(lái)說(shuō)，無(wú)異于驚雷。因?yàn)檫@證實(shí)了低溫電子顯微鏡能夠解析小的、重要的分子。“當(dāng)我看到TRPV1的結(jié)構(gòu)時(shí)，我激動(dòng)得一晚上睡不著覺。”Rubinstein說(shuō)道。

　　研究者們可能面臨更多這樣無(wú)眠的夜晚。Agard表示，會(huì)有更多膜蛋白相繼被解析出來(lái)。

　　上個(gè)月由Scheres和清華大學(xué)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家施一公合作發(fā)表的一篇文章就成功解析了一個(gè)膜蛋白。他們建立了γ-分泌酶的模型，γ-分泌酶負(fù)責(zé)合成與阿茲海默癥相關(guān)的β-淀粉斑。0.34納米分辨率的圖譜顯示，比較少見的遺傳性阿爾茨海默病的γ-分泌酶突變后會(huì)在圖譜上呈現(xiàn)兩個(gè)“熱點(diǎn)”(突變或者重組頻率顯著增加的位點(diǎn))，并且這種突變最終會(huì)合成有毒性的β-淀粉斑。γ-分泌酶的結(jié)構(gòu)圖幫助研究者發(fā)現(xiàn)為什么以往的抑制劑會(huì)無(wú)效，從而促進(jìn)新藥的研發(fā)。程亦凡表示，γ-分泌酶的結(jié)構(gòu)非常驚人。

　　類似的成功吸引了制藥公司的注意。他們希望借助低溫電子顯微鏡去解析那些無(wú)法結(jié)晶的蛋白，從而更好地研發(fā)藥物。Scheres如今和輝瑞公司合作，攻克離子通道。離子通道包含很多膜蛋白，例如痛感受分子和神經(jīng)遞質(zhì)受體。“我?guī)缀醣幻恳粋€(gè)人聯(lián)系過。”Nogales這樣說(shuō)道。

　　盡管低溫電子顯微鏡發(fā)展迅速，很多研究者認(rèn)為，它仍有巨大提升空間。他們希望能制造出更靈敏的電子探測(cè)器，以及更好地制備蛋白樣本的方法。這樣的話，就能夠?qū)Ω〉?、更?dòng)態(tài)的分子進(jìn)行成像，并且分辨率更高。5月，有研究者發(fā)表了一篇細(xì)菌蛋白的結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)到了0.22納米。這也顯示了低溫顯微鏡的潛力。

　　與任何熱門領(lǐng)域一樣，低溫電子顯微鏡的發(fā)展也有煩惱。一些專家擔(dān)心研究者們盲目追求該儀器會(huì)誘發(fā)一些問題。2013年HIV表面蛋白的結(jié)構(gòu)圖遭到了科學(xué)家們的質(zhì)疑，他們認(rèn)為用于建模的圖片很多都是白噪聲。此后，其他團(tuán)隊(duì)得到的X射線晶體衍射和低溫電子顯微鏡模型也對(duì)原模型提出了質(zhì)疑。但這些研究者們堅(jiān)持相信自己的結(jié)果。今年6月，在高登研究會(huì)議(Gordon Research Conference )上，研究者們希望低溫電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)圖要有嚴(yán)格的質(zhì)量控制。并且雜志要求作者們提供詳細(xì)的建模方法。

　　成本問題可能會(huì)限制低溫電子顯微鏡的推廣。Scheres估計(jì)，LMB每天用于支持低溫電子顯微鏡的經(jīng)費(fèi)就達(dá)到近3萬(wàn)人民幣，外加近1萬(wàn)的電費(fèi)——這是由于存儲(chǔ)和處理圖片的電腦耗電量很大。Scheres表示，每天至少要花費(fèi)近4萬(wàn)人民幣，對(duì)于很多地方來(lái)說(shuō)，這個(gè)費(fèi)用太高。為了推廣低溫電子顯微鏡，很多基金會(huì)建立了對(duì)外公開的設(shè)備，各地研究者們可以預(yù)約使用。霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所(Howard Hughes Medical Institute, HHMI)在珍利亞農(nóng)場(chǎng)研究園區(qū)配備了一臺(tái)。這臺(tái)設(shè)備對(duì)所有HHMI資金的研究者公開。在英國(guó)，政府和維康信托在牛津大學(xué)附近建立了低溫電鏡公開使用平臺(tái)。參與該平臺(tái)搭建的倫敦大學(xué)(University of London)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Helen Saibil表示，有很多人想學(xué)習(xí)使用低溫電鏡。

　　洛克菲勒大學(xué)(Rockefeller University)的生物物理學(xué)家Rod MacKinnon就是這些人之一。他在2003年因解析一些離子通道的結(jié)晶結(jié)構(gòu)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)。MacKinnon現(xiàn)在對(duì)低溫電鏡非常著迷。“我現(xiàn)在處于學(xué)習(xí)曲線的斜坡階段，非常熱切。” MacKinnon這樣說(shuō)道。他打算用低溫電鏡來(lái)研究離子通道是如何開和關(guān)的。

　　1997年時(shí)，Henderson非常堅(jiān)定地宣稱，低溫電鏡會(huì)成為解析蛋白結(jié)構(gòu)的主流工具。在將近20年后的今天，他的預(yù)測(cè)比當(dāng)年有了更多底氣。Henderson表示，如果低溫電鏡保持這樣的勢(shì)頭繼續(xù)發(fā)展，技術(shù)問題也得以解決，那么低溫電鏡不僅會(huì)成為解析蛋白結(jié)構(gòu)的第一選擇，而是主流選擇。這個(gè)目標(biāo)已經(jīng)離我們不遠(yuǎn)了。

　　原文檢索：

　　Ewen Callaway. (2015) The revolution will not be crystallized. Nature, 525(7568):172-174.