縱觀測序技術的發(fā)展歷程，沒有哪一個技術像納米孔測序那樣慢熱，但也沒有哪一個技術像納米孔測序這么接近普羅大眾。將單鏈DNA拉過蛋白孔，檢測堿基穿過時電導的微小改變，納米孔測序的這一基礎理念已經(jīng)有十幾年歷史了。
1996年哈佛大學的Daniel Branton、加州大學的David Deamer及其同事，在美國國家科學院院刊PNAS雜志上首次發(fā)表文章指出，可以用膜通道檢測多核苷酸序列。然而從第一篇論文到納米孔測序的成形，這條道路并不是一帆風順的。研究者們產(chǎn)生了很多分歧，也遇到了大量的技術死胡同。
一個平凡的開始
利用納米孔進行測序的理念是非常直觀的：讓DNA堿基一個個穿過納米孔，同時快速鑒定每一個堿基。然而真正實施起來人們卻遇到了很多問題。如何在堿基穿過的時候進行檢測?DNA鏈穿過納米孔時是否需要放慢速度?如何大量生成同樣大小的納米孔?
Deamer和Branton最初的想法是，給持續(xù)開啟的通道施加跨膜電壓，把線性DNA或RNA鏈拉過納米孔。這一過程會立刻改變納米孔的離子流，對此加以檢測就可以確定DNA或RNA的構(gòu)成。然而，在這種情況下DNA穿過納米孔的速度太快，難以進行有效檢測。
進入二十一世紀之后，越來越多的研究者致力于解決這些問題，讓納米孔測序成為現(xiàn)實。“可以說是NIH的$1000基因組計劃刺激了納米孔測序的發(fā)展，”Oxford Nanpore公司的創(chuàng)始人之一，牛津大學的Hagan Bayley最近撰文指出。
人們開始嘗試改良納米孔本身。天然的生物學通道(比如alpha-hemolysin)和開口小于2nm的人工納米孔都可以用于納米孔測序。研究者們發(fā)現(xiàn)，雖然人工納米孔免去了和生物學材料打交道的麻煩，但大規(guī)模制造這么小的納米孔實在太困難。最終，蛋白通道成為了納米孔測序的主流。
真正實現(xiàn)商業(yè)化
2005年，Bayley、Gordon Sanghera和Spike Wilcocks創(chuàng)立的Oxford Nanopore公司正式登場。為了開發(fā)穩(wěn)定可靠的納米孔測序平臺，該公司從2007年開始研發(fā)以蛋白為基礎的納米孔測序系統(tǒng)。2012年，該公司在AGBT(基因組生物學技術進展年會)上發(fā)布了自己的納米孔系統(tǒng)——MinION。
MinION是首個U盤大小的納米孔測序儀，價格在一千美元作用，一天能生成約1Gb數(shù)據(jù)。該系統(tǒng)發(fā)布之后很快引起了轟動，被許多人視為基因組測序的未來。然而直到2014年的AGBT，人們才首次看到MinION系統(tǒng)的實戰(zhàn)表現(xiàn)。
Broad研究所的David Jaffe在這次會議上展示了自己的MinION數(shù)據(jù)，他利用納米孔測序的長讀取來組裝細菌基因組。研究顯示，這個平臺的平均讀長大約在5kb左右，最長能達到20kb。對于這么小的裝置來說，這種測序能力是相當令人震撼的。雖然MinION的總體序列質(zhì)量和錯誤率受到了一些質(zhì)疑，但仍然有很多研究者希望嘗試這種迷你測序儀。
這一次，人們并沒有等太久。2014年Oxford Nanopore公司啟動了先期體驗項目，研究者只需要提供一千美元的押金和相應的運費，就可以獲得測序設備和一次性的流動槽，在自己的項目中嘗試MinION系統(tǒng)。
2015年初，先期體驗項目的數(shù)據(jù)陸續(xù)發(fā)布出來。三月份，Exeter大學的研究人員在Biomolecular Detection and Quantification雜志上發(fā)表文章，對MinION系統(tǒng)性能進行了評估。文章寫到“作為首個基于納米孔的商業(yè)化單分子測序儀，MinION是很有前景的。然而，目前的錯誤率限制了它與現(xiàn)有測序技術競爭的能力。不過我們發(fā)現(xiàn)，MinION與Illumina MiSeq數(shù)據(jù)結(jié)合起來使用，有助于de novo基因組裝配。”
七月份，一個瑞典研究團隊用MinION建立了細菌基因組草圖。研究表明，這一系統(tǒng)生成了能定位的長讀取，精確度達到79%。作者們總結(jié)道，“隨著進一步的技術發(fā)展，我們相信MinION不僅可用于基因組裝配，也能用于實地的快速檢測。”此外，還有研究者用MinION對綠膿桿菌和大腸桿菌E.coli進行了測序。
高通量就在前方
納米孔測序目前還處于發(fā)展初期。除了解決錯誤率問題，平行測序能力對于這一技術的推廣也很重要。問題是，怎樣才能同時評估成千上萬個納米孔的離子流改變。
八月份，Hagan Bayley和牛津大學的研究人員在這方面取得了突破性進展。他們開發(fā)的光傳感納米孔芯片，能夠同時檢測大量的納米孔。檢測方法的改變是這項研究的關鍵所在。Bayley等人將納米孔的離子流變化轉(zhuǎn)化為可以直接觀測到的熒光改變，并在多種蛋白納米孔(包括alpha-hemolysin)中展示了這一技術的可行性。這一技術為大規(guī)模納米孔測序平臺奠定了基礎。
參考文獻：
1. Kasianowicz J.J., Brandin, E., Branton, D., and Deamer, D.W. 1996. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 93(24): 13770-13773.
2. Laver, T. et al. 2015. Assessing the performance of the Oxford Nanopore Technologies MinION. Biomolecular Detection and Quantification, Vol 3, pg 1-8.
3. Karlsson, A et al. 2015. Scaffolding of a bacterial genome using MinION nanopore sequencing. Scientific Reports, doi: 10.138/srep11996
4. Huang S. et al. 2015. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array. Nature Nanotechnology. doi: 10.1038/nnano.2015.189
