在胃癌（GC）發(fā)生過程中，DAN甲基化轉(zhuǎn)移酶3A的功能作用機制目前還不是很清楚。在該研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)外源表達的DNMT3A通過打亂G1/S的轉(zhuǎn)換而促進肝癌的細胞增殖。同時該研究找到了DNMT3A的下游靶基因p18INK4C，異位表達DNMT3A在轉(zhuǎn)錄層次抑制了p18INK4C的表達水平。在GC細胞中減弱p18INK4C的表達誘導細胞周期過程，在DNMT3A過表達細胞中重表達p18INK4C可減弱G1/S的轉(zhuǎn)換。深入研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3A通過直接調(diào)控p18INK4C啟動子區(qū)的甲基化程度來影響其表達。臨床GC樣本檢測發(fā)現(xiàn)，癌組織中p18INK4C的甲基化水平明顯高于配對癌旁組織，DNMT3A的表達水平與p18INK4C的表達呈負相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提出了胃致癌過程的新的見解，也為胃癌治療提供了潛在的靶標。該研究中DNMT3A下游靶基因篩選表達譜芯片Affymetrix HTA2.0由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供。
研究背景：
在腫瘤發(fā)生的早期過程中，表觀遺傳調(diào)控機制——DNA甲基化起著非常重要的作用。真核細胞表達3個DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶：DNMT1，DNMT3A和DNMT3B。其中，已有研究發(fā)現(xiàn)DNMT1和DNMT3B在腫瘤的起始和發(fā)展階段發(fā)揮著重要作用，但是，對于DNMT3A在腫瘤中的功能作用機制還不是很清楚。
胃癌在世界范圍內(nèi)，尤其是在中國，是一種最常見的高發(fā)病率和死亡率的惡性腫瘤之一。有研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A在多種腫瘤（包括胃癌）中表達異常。在胃癌中，尤其是DNMT3A的表達明顯比DNMT1和DNMT3B高。最近的研究也發(fā)現(xiàn)在胃癌病人中，只有DNMT3A的高表達伴隨著差的總體生存率。這些發(fā)現(xiàn)預示著，在胃癌中，DNMT3A可能扮演著非常重要的角色。因此，深入研究胃癌發(fā)生過程中DNMT3A的功能作用機制顯得尤為重要。
研究思路：
研究結(jié)果：
1. DNMT3A對GC細胞的增殖非常重要
首先，研究人員對胃癌細胞系AGS和BGC-823進行了DNMT3A基因的敲降（AGS-shDNTM3A和 BGC-shDNTM3A），發(fā)現(xiàn)細胞生長速率顯著降低，foci formation形成頻率也降低。當檢測外源過量表達DNMT3A細胞系MKN45時發(fā)現(xiàn)，生長速率顯著增加。在裸鼠中移植AGS-shDNTM3A和 BGC-shDNTM3A細胞系后發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯比對照小。這些結(jié)果表明DNMT3A對胃癌細胞的增殖是必需的。
2. DNMA3A通過打亂G1/S的轉(zhuǎn)換促進細胞生長
腫瘤細胞的生長紊亂通常與細胞周期過程的加快相關(guān)。同樣處于G1期（72%）的AGS-shDNTM3A和對照釋放12h后，敲降組中處于G1期的細胞比率明顯高于對照。在過表達細胞系MKN45和BGC-823中得到了相反的結(jié)果。為了探究該現(xiàn)象的內(nèi)在分子機制，研究人員對敲降和過表達細胞系中的7個G1/S轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)基因的表達進行了檢測，發(fā)現(xiàn)cyclinD1, CDK4 和CDK6在過表達細胞系中表達增加，敲降細胞系表達降低。這些結(jié)果表明DNMT3A通過破壞G1/S的轉(zhuǎn)換刺激細胞周期過程的發(fā)生。
3. DNMT3A下游靶基因鑒定
為了深入研究DNMT3A調(diào)控胃癌細胞周期過程的作用機制，研究人員進行了下游調(diào)控基因篩選。通過對過表達細胞系和對照細胞系表達譜芯片（HTA2.0）檢測后發(fā)現(xiàn)，有558個下調(diào)和348個上調(diào)基因。GO分析發(fā)現(xiàn)主要的分子功能涉及結(jié)合與催化活性功能，生物學過程涉及細胞增殖，細胞粘附，細胞周期過程等，暗示著DNMT3A可能通過這些過程影響致癌。
（a） 表達譜芯片篩選差異基因GO分子功能分析結(jié)果；
（b） 表達譜芯片篩選差異基因GO生物學過程分析結(jié)果。
在其中有5個下調(diào)基因與細胞周期過程相關(guān)：BLM, CDKN1B, CCNE2,p18INK4C和CKS1B，他們與CDK的活性調(diào)控關(guān)系密切。qRT-PCR結(jié)果驗證表明DNMT3A抑制了p18INK4C表達，當在過表達細胞系MKN45-DNMT3A中加入DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5-Aza）后，p18INK4C的表達異常得到恢復。這些結(jié)果表明p18INK4C是DNMT3A的主要下游靶基因。
4. p18INK4C涉及DNMT3A調(diào)控的G1/S轉(zhuǎn)換
流式細胞分選實驗表明，在細胞中敲降p18INK4C可以增加G1/S轉(zhuǎn)換的細胞數(shù)量。Western blot分析顯示，CDK4和CDK6的蛋白表達增加。當在DNMT3A過表達細胞系中重表達p18INK4C后發(fā)現(xiàn)細胞生長速率減慢，G1期的細胞比率恢復。異位表達p18INK4C可以抑制CDK4和CDK6的蛋白表達。這些結(jié)果表明p18INK4C參與DNMT3A誘導的G1/S轉(zhuǎn)換。
5. DNMT3A通過DNA甲基化抑制p18INK4C的表達
DNMT3A敲降細胞系BGS檢測p18INK4C啟動子區(qū)CpG island區(qū)域，發(fā)現(xiàn)甲基化程度明顯低于對照。ChIP實驗表明DNMT3A可結(jié)合到p18INK4C啟動子的CpG island區(qū)域。這些結(jié)果表明DNMT3A可以直接結(jié)合到p18INK4C啟動子區(qū)的CpG island區(qū)域影響其甲基化程度。
6. 臨床GC樣本中p18INK4C甲基化程度異常
25對臨床GC樣本和癌旁樣本檢測p18INK4C啟動子區(qū)的25個CpG位點，發(fā)現(xiàn)癌組織中甲基化水平明顯高于癌旁，p18INK4C的mRNA水平也顯著降低。
7. 臨床GC樣本中DNMT3A與p18INK4C表達相關(guān)
35對臨床GC樣本和癌旁樣本檢測DNMT3A表達，發(fā)現(xiàn)有22個（63%）中蛋白表達升高，并且與臨床病理指標一致。qRT-PCR檢測p18INK4CmRNA表達水平發(fā)現(xiàn)其與DNMT3A蛋白表達水平負相關(guān)。
該研究中DNMT3A下游靶基因篩選表達譜芯片Affymetrix HTA2.0由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供。
原文出處: Cui H, Zhao C, Gong P, Wang L, Wu H, Zhang K, Zhou R, Wang L, Zhang T, Zhong S, Fan H. DNA methyltransferase 3A promotes cell proliferation by silencing CDK inhibitor p18INK4C in gastric carcinogenesis. Sci Rep. 2015; 5: 13781.
