細(xì)胞里面的生命活動(dòng)井然有序，每一個(gè)部分都有其特定的結(jié)構(gòu)，承擔(dān)不同的功能。生物大分子則是一切生命活動(dòng)的最終執(zhí)行者，它們主要是核酸和蛋白。核酸攜帶了生命體的遺傳信息，而蛋白是生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者。自現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生以來(lái)的半個(gè)世紀(jì)里，解析和分析生物大分子的結(jié)構(gòu)、進(jìn)而闡釋其功能機(jī)制一直都是現(xiàn)代生命科學(xué)的核心問(wèn)題之一。

　　事實(shí)上，一切自然科學(xué)都涉及物質(zhì)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)間的相互作用為核心的研究方向，天文學(xué)研究宇宙、星體等的結(jié)構(gòu)及其相互作用，粒子物理研究物質(zhì)世界的基本粒子的結(jié)構(gòu)和相互作用，甚至包括應(yīng)用性很強(qiáng)的材料科學(xué)都是以研究新型材料的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等為核心。結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的直接目的是弄清楚生命大分子結(jié)構(gòu)，從而更好地理解生命，理解這個(gè)自然界中“逆熱力學(xué)第二定律”而誕生的奇跡;最終目標(biāo)是公眾通常關(guān)心的實(shí)用價(jià)值。

　　像數(shù)學(xué)物理公式不會(huì)直接造出飛機(jī)、導(dǎo)彈、計(jì)算機(jī)一樣，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)這樣的基礎(chǔ)研究不會(huì)直接轉(zhuǎn)化為人們生產(chǎn)生活的必須物品。比較具體的應(yīng)用，如藥物設(shè)計(jì)、疫苗開(kāi)發(fā)、醫(yī)療診斷和蛋白質(zhì)分子性能改造(如科學(xué)實(shí)驗(yàn)或工業(yè)生產(chǎn)中酶活性穩(wěn)定性?xún)?yōu)化)等是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究比較容易被大眾所理解的一個(gè)方向，但卻只是其研究?jī)r(jià)值的一個(gè)側(cè)面而已。

　　蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)如同生命科學(xué)里的數(shù)學(xué)公式和物理定律，甚至在以后會(huì)充當(dāng)生命科學(xué)里面的“化學(xué)元素周期表”，除了幫助發(fā)現(xiàn)或設(shè)計(jì)新藥等，它更重要的價(jià)值是作為最基礎(chǔ)最上游的研究之一，通過(guò)影響一切與其密切相關(guān)的下游科學(xué)和技術(shù)，從而改變我們的世界。

　　結(jié)構(gòu)生物學(xué)最早誕生于上個(gè)世紀(jì)中葉，它是一門(mén)通過(guò)研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)來(lái)闡明生命現(xiàn)象的學(xué)科，在其發(fā)展史上有兩個(gè)里程碑式的事件，一個(gè)是 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，另一個(gè)肌紅蛋白(Myglobin)晶體結(jié)構(gòu)的解析，這兩個(gè)事件都是上個(gè)世紀(jì)最重要的革命性科學(xué)進(jìn)展，均在劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，并且都于1962年獲得了諾貝爾獎(jiǎng)(一個(gè)生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，一個(gè)化學(xué)獎(jiǎng))。同時(shí)它們都是最早使用X射線(xiàn)的方法來(lái)解析生物大分子結(jié)構(gòu)，而這個(gè)方法在過(guò)去半個(gè)世紀(jì)里，一直占據(jù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的統(tǒng)治地位。

　　在當(dāng)今結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中普遍使用的冷凍電鏡，是上個(gè)世紀(jì)七八十年代開(kāi)始出現(xiàn)、近兩年飛速發(fā)展的革命性技術(shù)，它可以快速、簡(jiǎn)易、高效、高分辨率解析高度復(fù)雜的超大生物分子結(jié)構(gòu)(主要是蛋白質(zhì)和核酸)，在很大程度上取代并且大大超越了傳統(tǒng)的X射線(xiàn)晶體學(xué)方法。

　　革命性的冷凍電鏡技術(shù)

　　冷凍電鏡并不是這兩年才建立的。在蛋白質(zhì)X射線(xiàn)晶體學(xué)誕生大約10多年以后的1968年， 作為里程碑式的電鏡三維重構(gòu)方法，同樣在劍橋MRC 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室誕生，Aron Klug教授因此獲得了1982年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。另一些突破性的技術(shù)在上世紀(jì)70年代和80年代中葉誕生，主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術(shù)。這里面的代表科學(xué)家有Ken Taylor, Robert Glaeser和Jacques Dubochet等。

　　快速冷凍可以使蛋白質(zhì)和所在的水溶液環(huán)境迅速?gòu)娜芤簯B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡB(tài)，玻璃態(tài)能使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保持其天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)，如果以緩慢溫和的方式冷凍，這個(gè)過(guò)程會(huì)形成晶體冰，生物分子的結(jié)構(gòu)將被晶格力徹底損壞。低劑量冷凍成像能夠保存樣品的高分辨率結(jié)構(gòu)信息，確保了從電鏡圖形中解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可能性。與此同時(shí)Joachim Frank等則在電鏡圖像處理算法方面奠定和發(fā)展了這項(xiàng)技術(shù)的理論基礎(chǔ)。由此冷凍電鏡的雛形基本建立，總的思路為：

　　1)樣品冷凍(保持蛋白溶液態(tài)結(jié)構(gòu));

　　2)冷凍成像(獲取二維投影圖像);

　　3)三維重構(gòu)(從二維圖像通過(guò)計(jì)算得到三維密度圖)。

　　該方法為生物大分子結(jié)構(gòu)研究提供了一個(gè)和X射線(xiàn)晶體學(xué)完全不一樣的、全新的思路。但是由于技術(shù)方法的瓶頸，在此后30多年的時(shí)間里只能做一些相對(duì)低分辨率的結(jié)構(gòu)解析工作，在分辨率上一直不能和X射線(xiàn)晶體學(xué)比較，甚至一度被嘲笑為”blob-ology“(英文諷刺語(yǔ)，“一坨輪廓的技術(shù)”)。

冷凍電鏡三維重構(gòu)得到的電子云密度圖和原子模型(局部)。張凱供圖

　　但對(duì)于冷凍電鏡來(lái)說(shuō)，技術(shù)難點(diǎn)遠(yuǎn)非單純冷凍。冷凍成像和圖像處理算法一直都是瓶頸。從冷凍電鏡技術(shù)誕生以來(lái)的近30年時(shí)間里，其一直都有進(jìn)展，只是相對(duì)比較緩慢。

　　最重要的革命性事件大約發(fā)生在兩三年前：一個(gè)是直接電子探測(cè)器的發(fā)明，另一個(gè)是高分辨率圖像處理算法的改進(jìn)。MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的兩位科學(xué)家Richard Henderson和Sjors Scheres在這次革命中起了關(guān)鍵作用(作者注：現(xiàn)代科技革命往往是諸多研究機(jī)構(gòu)若干團(tuán)隊(duì)共同參與，此處僅列舉關(guān)鍵代表，并且僅從技術(shù)角度討論，不涉及生物學(xué)應(yīng)用)。

　　Richard Henderson是探測(cè)器方面的先驅(qū)，而Sjors Scheres則因他設(shè)計(jì)的Relion程序而名聲大噪，他們由此當(dāng)選為《自然》雜志2014年“十大科學(xué)進(jìn)展年度人物”。兩位科學(xué)家一個(gè)從硬件，一個(gè)從軟件將冷凍電鏡技術(shù)推向了巔峰，將冷凍電鏡技術(shù)的分辨率推向了新高度。(作者注: Henderson教授的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)非探測(cè)器一個(gè)方面，包括冷凍電鏡理論基礎(chǔ)、算法、軟件，重要生物大分子應(yīng)用，如曾首次解析視紫紅質(zhì)跨膜螺旋等等方面;早在20多年前，他就通過(guò)一系列理論分析，預(yù)言了冷凍電鏡研究的尺度、分辨率極限、技術(shù)瓶頸等等，并且斷言：冷凍電鏡將超越其它一切技術(shù)方法，成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的主導(dǎo)工具，如今這些預(yù)言全部應(yīng)驗(yàn)。)

　　和此前使用的CCD相比，新發(fā)展的直接電子探測(cè)器不僅在電鏡圖形質(zhì)量上有了質(zhì)的飛躍，同時(shí)在速度上大幅提高，還可以以電影的形式快速記錄電鏡圖像。這些特性同時(shí)也伴隨著電鏡圖像處理方面的重大變革，電鏡技術(shù)此前在分辨率上的一個(gè)主要瓶頸是電子束擊打生物樣品造成的圖像漂移和輻射損傷。有了快速電影記錄，我們就可以追蹤圖像漂移軌跡而對(duì)圖像做運(yùn)動(dòng)矯正和輻射損傷矯正，大大提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。

　　盡管如此，電鏡圖像處理一直都是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)，主要的問(wèn)題是冷凍電鏡的圖像噪音極高、信號(hào)極低，而我們的目標(biāo)是從中提取近原子分辨率的結(jié)構(gòu)信息，這就像在一個(gè)機(jī)器轟鳴的工廠(chǎng)里監(jiān)測(cè)一只螞蟻爬行的聲音。冷凍電鏡科學(xué)家就是要完成這項(xiàng)艱巨的任務(wù)，并且真的做到了。有了硬件和軟件方面的雙重提高，冷凍電鏡的分辨率目前已得到了極大的提高，可以和晶體學(xué)相媲美;并且在其它方面已經(jīng)大大超越了晶體學(xué)。

　　主要體現(xiàn)在下面幾個(gè)方面：

　　第一，不需要結(jié)晶，研究對(duì)象范圍大大擴(kuò)展，研究速度大大提高。對(duì)于小分子，比方說(shuō)無(wú)機(jī)鹽礦物質(zhì)等自發(fā)就能長(zhǎng)出晶體，小而且穩(wěn)定的蛋白質(zhì)目前來(lái)說(shuō)結(jié)晶并不困難，但是這類(lèi)意義重大的蛋白幾乎都已經(jīng)解析完了，在科學(xué)上沒(méi)有任何重大意義;當(dāng)今時(shí)代，小蛋白已經(jīng)完全不能滿(mǎn)足科學(xué)家們強(qiáng)烈的探索欲望，結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的對(duì)象越來(lái)越大，體系越來(lái)越復(fù)雜，結(jié)晶幾乎成為不可能的事情，即使能結(jié)晶，也不一定衍射，有衍射也不一定能得到原子分辨率結(jié)構(gòu)。

　　很多年前，許多蛋白質(zhì)晶體科學(xué)家為了完成一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，一個(gè)課題少則5到10年，多則20年，核糖體從上世紀(jì)80年代初首次長(zhǎng)出晶體到 2000年左右最終拿到原子分辨率結(jié)構(gòu)整整經(jīng)歷了20年;線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物I從上世紀(jì)90年代初研究，第一次報(bào)道完整晶體結(jié)構(gòu)大約是20年以后。

　　而冷凍電鏡方法跳過(guò)超大分子復(fù)合物結(jié)晶難的這層技術(shù)屏障，以直接解析復(fù)合物的溶液狀態(tài)的結(jié)構(gòu)為目標(biāo)。

　　現(xiàn)在利用這項(xiàng)技術(shù)，在MRC-LMB一周時(shí)間就可以解析一個(gè)新的核糖體結(jié)構(gòu);英國(guó)皇家學(xué)會(huì)主席、MRC-LMB結(jié)構(gòu)中心主任 Venki Ramakrishnan 教授，因?yàn)楹颂求w的晶體結(jié)構(gòu)研究而獲得2009年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。他的實(shí)驗(yàn)室在2014年發(fā)表了最后一篇晶體結(jié)構(gòu)文章，此后的文章全部以冷凍電鏡為主。哥倫比亞大學(xué)有一個(gè)非常執(zhí)著的博士后，研究蘭尼堿受體(Ryanodine Receptor)晶體結(jié)構(gòu)長(zhǎng)達(dá)十年之久，最后放棄了晶體，轉(zhuǎn)向了冷凍電鏡技術(shù)，同時(shí)與清華大學(xué)教授顏寧和LMB的Scheres研究組合作，幾個(gè)月就解決了這個(gè)難題，并且達(dá)到近原子分辨率。

　　第二，樣品需求量小，樣品制備快，可重復(fù)性高。重要生物樣品都是非常珍貴的，總體來(lái)說(shuō)是以微克或者最多以毫克來(lái)計(jì)量，即使得到這點(diǎn)樣品，也要花費(fèi)生物學(xué)家?guī)字堋讉€(gè)月甚至更長(zhǎng)的時(shí)間(大多數(shù)時(shí)候都需要摸索各種條件使樣品處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，以便做進(jìn)一步結(jié)構(gòu)研究)。

　　蛋白質(zhì)晶體一般要求高濃度大體積，沒(méi)有量變就沒(méi)有質(zhì)變。而同樣量的蛋白可以稀釋以后制備若干冷凍電鏡樣品，每個(gè)樣品有成百上千的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域有幾百個(gè)小孔，每一個(gè)小孔甚至可以收集多張照片。解析一般蛋白的原子結(jié)構(gòu)需要幾萬(wàn)個(gè)顆粒，而對(duì)于高對(duì)稱(chēng)性的樣品幾千個(gè)顆粒就足夠。

　　第三，可以研究天然的、動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)。X射線(xiàn)晶體學(xué)研究生物大分子結(jié)構(gòu)的一個(gè)主要弱點(diǎn)是無(wú)法拿到天然的動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)檠芯咳藛T無(wú)論如何也無(wú)法繞開(kāi)結(jié)晶這個(gè)過(guò)程。冷凍電鏡就是要做這件事情：直接解析天然的、溶液態(tài)的、動(dòng)態(tài)的(dynamic)，甚至原位(in situ)的結(jié)構(gòu)，從而理解生命分子如何在空間和時(shí)間兩個(gè)尺度上以活的動(dòng)態(tài)的方式發(fā)揮功能。

　　晶體學(xué)只能?chē)L試不同的條件獲得生物大分子某個(gè)或者某些固定的狀態(tài)，而且容易出現(xiàn)晶體堆積引起的不真實(shí)相互作用方式。形象地說(shuō)，冷凍電鏡可以制作完整的高清電影，晶體學(xué)只能從電影里截屏。

　　第四，技術(shù)革命還將開(kāi)啟巨大的潛在醫(yī)療價(jià)值。冷凍電鏡技術(shù)方法在時(shí)間和精度方面的大幅度提高有時(shí)會(huì)導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的重大科學(xué)和應(yīng)用價(jià)值。比如，活體病毒結(jié)構(gòu)分析如果可以在分鐘級(jí)別完成，這將有可能轉(zhuǎn)化為潛在的醫(yī)療檢測(cè)手段：從病人體內(nèi)抽取血樣或感染組織細(xì)胞，幾分鐘以后，非常清晰明了地展現(xiàn)病人在細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)層面的異常狀況，甚至給出局部的原子結(jié)構(gòu)圖，從而給出精準(zhǔn)的治療方案。這個(gè)想法現(xiàn)在可能聽(tīng)起來(lái)有點(diǎn)像笑話(huà)，或許再過(guò)若干年人們就不這樣認(rèn)為了。

　　當(dāng)然冷凍電鏡的革命性不僅僅體現(xiàn)在上述四方面，在此就不一一列舉。有關(guān)冷凍電鏡更加詳細(xì)的介紹，可參見(jiàn)筆者等2010年的中文綜述(《生物物理學(xué)報(bào)》，2010年7月，第26卷，第7期: 533-559)。文章中對(duì)未來(lái)幾年的發(fā)展趨勢(shì)所做的展望，如直接電子探測(cè)器的普及、非對(duì)稱(chēng)性蛋白復(fù)合物近原子分辨率結(jié)構(gòu)解析、冷凍電鏡相關(guān)計(jì)算性能的大規(guī)模提升等等，目前絕大多數(shù)都在過(guò)去的兩三年內(nèi)得以實(shí)現(xiàn)并飛速發(fā)展。

　　華人學(xué)者在冷凍電鏡領(lǐng)域的貢獻(xiàn)

　　在冷凍電鏡的這場(chǎng)技術(shù)革命中，華人科學(xué)家功不可沒(méi)，在某些方面甚至獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷，做出了諸多重大成果。

　　加州大學(xué)舊金山分校(UCSF)的華人科學(xué)家程亦凡教授在2013年底，首次利用冷凍電鏡技術(shù)解析近原子分辨率膜蛋白結(jié)構(gòu)，這項(xiàng)成果在業(yè)界引起了巨大轟動(dòng)。原因在于當(dāng)所有電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)家還在討論膜蛋白到底能不能利用冷凍電鏡技術(shù)看到二級(jí)結(jié)構(gòu)，也是通常我們認(rèn)為的中等分辨率水平的時(shí)候，程亦凡教授研究組直接解析了TRPV1 這個(gè)膜蛋白3.3埃近原子分辨率的結(jié)構(gòu)(Nature，504：107–112)。

　　筆者曾在該文章發(fā)表的半年前在一次國(guó)際會(huì)議上和冷凍電鏡領(lǐng)域頂級(jí)學(xué)者深入討論過(guò)如何獲得清晰的膜蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)，對(duì)方給出了悲觀的結(jié)論：“恐怕不太可能，至少最近兩年不可能”。

　　事實(shí)上，此前蛋白質(zhì)晶體學(xué)家已經(jīng)有所耳聞“冷凍電鏡可能在未來(lái)幾年會(huì)超越并且取代晶體學(xué)”，但是誰(shuí)也沒(méi)想到會(huì)是以這樣快速和震撼的方式登場(chǎng)，這在某種程度上引發(fā)了不少蛋白質(zhì)晶體學(xué)家的“職業(yè)恐慌感”。這項(xiàng)成果的兩個(gè)共同第一作者廖茂福、曹爾虎也都是非常杰出的青年華人科學(xué)家。

　　加州大學(xué)洛杉磯分校的周正洪教授早在2008年到2010年左右，在這場(chǎng)電鏡技術(shù)革命來(lái)臨之前，在各項(xiàng)技術(shù)條件尚未成熟的情況下解析了一系列近原子分辨率病毒結(jié)構(gòu)。當(dāng)時(shí)采用的是傳統(tǒng)膠片來(lái)成像，任務(wù)非常艱巨，連他還在上學(xué)的兒子也都幫忙一起洗膠片。張興博士在這一系列稍早的重要成果中充當(dāng)了先鋒。早在2008年，第一個(gè)近原子分辨率的冷凍結(jié)構(gòu)，也即3.8埃輪狀病毒就是張興博士作為第一作者完成的(PNAS, 105(6): 1867-1872)。從1968年Aaron Klug創(chuàng)立電鏡三維重構(gòu)理論，到2008年人們首次看到通過(guò)冷凍電鏡獲得近原子分辨率結(jié)構(gòu)，整整用了40年。

　　在國(guó)內(nèi)，清華大學(xué)的隋森芳院士是我國(guó)冷凍電鏡領(lǐng)域的先驅(qū)，不僅德高望重，還培養(yǎng)了一大批優(yōu)秀的青年科學(xué)家，包括清華大學(xué)的王宏偉教授以及 MRC-LMB的白曉晨和暢磊福博士等等。王宏偉早年在隋老師實(shí)驗(yàn)室做研究生的時(shí)候，在我國(guó)研究設(shè)備和條件全面落后于國(guó)外的情況下依舊做出了許多非常出色的工作。

　　MRC-LMB的多位青年華人研究人員對(duì)冷凍電鏡發(fā)展都做出了重要貢獻(xiàn)。白曉晨博士在MRC-LMB首次使用直接電子探測(cè)設(shè)備Falcon I 和Sjors Scheres博士的新程序Relion，獲得了第一個(gè)不對(duì)稱(chēng)樣品核糖體的近原子分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，打響了冷凍電鏡革命的第一槍?zhuān)S后解析了一系列核糖體和蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)。暢磊福博士在LMB首次獲得非核糖體不對(duì)稱(chēng)蛋白樣品APC復(fù)合物的近原子分辨率結(jié)構(gòu)，闡明了蛋白質(zhì)泛素化的重要機(jī)理。筆者主要在LMB的Andrew Carter博士實(shí)驗(yàn)室從事動(dòng)力蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究，并成功解析動(dòng)力蛋白激活因子Dynactin結(jié)構(gòu)，提出了目前為止動(dòng)力蛋白最詳盡可靠的運(yùn)動(dòng)和激活機(jī)制(Science, 347(6229):1441-1446. 封面文章)，同時(shí)獨(dú)立發(fā)展冷凍電鏡技術(shù)方法。

　　1953年4月25日，MRC沃森和克里克在《自然》雜志發(fā)表DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，61年后的同一天，我國(guó)科學(xué)家、中科院生物物理研究所的朱平和李國(guó)紅研究員在《科學(xué)》雜志以長(zhǎng)文形式發(fā)表了30nm染色質(zhì)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)(DNA雙螺旋之雙螺旋)(Science , 344(6182): 376-380)。這項(xiàng)工作是冷凍電鏡在核心生命科學(xué)問(wèn)題中的成功應(yīng)用，冷凍電鏡部分的工作主要是筆者在生物物理所的同學(xué)宋峰博士完成的。

　　生物物理所的程凌鵬博士(當(dāng)前單位為清華大學(xué))獲得國(guó)內(nèi)本土第一個(gè)原子分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了蠶多角體病毒(CPV)的完整三維原子模型(PNAS，108(4)：1373-1378)。筆者也參與了部分工作, 被其高質(zhì)量、干凈的電子密度圖震撼。近期程凌鵬與劉紅榮博士合作，在國(guó)際上首次發(fā)表了CPV完整基因組和RNA聚合酶“原位三維結(jié)構(gòu)” (Science, 2015, 349(6254):1347-50), 引起了很大轟動(dòng)，這項(xiàng)成果是我國(guó)本土冷凍電鏡技術(shù)和生物學(xué)應(yīng)用的雙重突破，被多名同行科學(xué)家稱(chēng)贊為”里程牌式發(fā)現(xiàn)“。

　　我國(guó)著名科學(xué)家施一公最近發(fā)表了一系列重大蛋白復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，包括γ-secretase、spliceosome等，被譽(yù)為過(guò)去幾十年我國(guó)科學(xué)家對(duì)基礎(chǔ)生物學(xué)領(lǐng)域的最大貢獻(xiàn)。

　　另外，在歐美和中國(guó)本土還有一大批華人學(xué)者在冷凍電鏡或密切相關(guān)領(lǐng)域(cryoET等)做出諸多突破性成果，例如匹茲堡大學(xué)的張佩君教授(艾滋病毒結(jié)構(gòu)研究)，德克薩斯大學(xué)的劉俊教授(細(xì)菌運(yùn)動(dòng)，噬菌體結(jié)構(gòu)等研究)等，由于時(shí)間和篇幅問(wèn)題，無(wú)法一一介紹。

　　冷凍電鏡的未來(lái)展望

　　冷凍電鏡技術(shù)目前仍然在快速發(fā)展中，未來(lái)冷凍電鏡能做什么取決于這項(xiàng)技術(shù)能發(fā)展到什么程度?，F(xiàn)代科學(xué)技術(shù)革命的一個(gè)最大特點(diǎn)是發(fā)展速度極其迅速，誰(shuí)也不知道明天會(huì)發(fā)生什么，當(dāng)然也不能十分準(zhǔn)確的預(yù)知一個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展方向。即便如此，筆者還是對(duì)這個(gè)領(lǐng)域有一些預(yù)測(cè)或期待(僅技術(shù)角度，不涉及具體生物學(xué)研究)。

　　1)超大規(guī)模、超快速度數(shù)據(jù)采集和處理。和晶體學(xué)相比，冷凍電鏡的效率在某些方面已經(jīng)異常驚人。比如筆者近期與牛津大學(xué)王祥喜博士合作，在幾個(gè)小時(shí)以?xún)?nèi)就可以拿到完整甲肝病毒原子結(jié)構(gòu)，而此前王祥喜博士花費(fèi)近一年時(shí)間結(jié)晶才最終拿到原子結(jié)構(gòu)。但是科學(xué)技術(shù)發(fā)展是永無(wú)止境的̷̷

　　但目前來(lái)說(shuō)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的巨大轉(zhuǎn)型必須建立在速度和效率的雙重前提下。這需要硬件、軟件以及其它交叉學(xué)科等多方面的共同發(fā)展。

　　除了生物學(xué)研究應(yīng)用，筆者一直致力于冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，最近在提高電鏡數(shù)據(jù)處理結(jié)果可靠性和分辨率前提下，上千倍地提高了其中幾個(gè)環(huán)節(jié)，過(guò)去幾百到上千CPU小時(shí)的事情，現(xiàn)在幾分鐘到幾十分鐘就完成了。但是這只是部分環(huán)節(jié)，在其它方面依舊非常耗時(shí)，整個(gè)技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)如何全面高效高速地完成還需要更多的優(yōu)秀人才參與。對(duì)硬件的發(fā)展方面筆者并不是很熟悉，預(yù)計(jì)在未來(lái)會(huì)出現(xiàn)超高速度的電子顯微鏡，大幅度提高電鏡原始數(shù)據(jù)的數(shù)量和質(zhì)量。

　　2)大尺度、高分辨率、高動(dòng)態(tài)的生物大分子結(jié)構(gòu)解析。理論上，冷凍電鏡可像高清數(shù)碼攝像機(jī)拍電影一樣對(duì)生物大分子成像和重現(xiàn)其動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，研究深層機(jī)理。就目前而言，這一方面在技術(shù)上遠(yuǎn)未成熟。大尺度、高分辨率、高動(dòng)態(tài)這幾點(diǎn)拆解開(kāi)來(lái)，每一個(gè)都不算太難，但是同時(shí)滿(mǎn)足這幾項(xiàng)需求幾乎成為不可能的事情。但是這是未來(lái)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方向，我們不僅僅要看簡(jiǎn)單的幾張靜態(tài)照片，我們還想看高清電影。

　　關(guān)于這一點(diǎn)，筆者需要強(qiáng)調(diào)一下結(jié)構(gòu)生物學(xué)和動(dòng)力學(xué)模擬的區(qū)別。結(jié)構(gòu)生物學(xué)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)目的是以實(shí)驗(yàn)手段完整復(fù)原自然狀態(tài)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，理解其中機(jī)理，是從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)出發(fā)“重現(xiàn)大自然原貌”的過(guò)程，是完完全全可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而動(dòng)力學(xué)模擬是從已有的理論或經(jīng)驗(yàn)性的物理學(xué)規(guī)律出發(fā)預(yù)測(cè)一個(gè)生物大分子的動(dòng)態(tài)特性，存在巨大的不確定性，其結(jié)果可靠性較差。期待在未來(lái)的某個(gè)時(shí)刻，兩者會(huì)像上個(gè)世紀(jì)的理論物理和實(shí)驗(yàn)物理一樣完美地結(jié)合，相互促進(jìn)。

　　大尺度復(fù)雜生物系統(tǒng)的高分辨率、動(dòng)態(tài)機(jī)理研究涉及諸多學(xué)科，不是冷凍電鏡一項(xiàng)技術(shù)就可以完成的，需要多學(xué)科科學(xué)家共同參與完成。

　　3)高分辨單分子及原位結(jié)構(gòu)研究。目前的結(jié)構(gòu)生物學(xué)，無(wú)論晶體學(xué)、冷凍電鏡還是核磁共振主要還是在研究“群體”結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡相對(duì)晶體學(xué)在這一方面已經(jīng)有了大幅度提高，可以通過(guò)分類(lèi)的方法研究群體結(jié)構(gòu)中的每一類(lèi)結(jié)構(gòu)。但實(shí)際上每個(gè)分子在時(shí)間和空間上除了共性，也必然有特性，如果一種方法強(qiáng)大到可以測(cè)得單個(gè)分子的高分辨率結(jié)構(gòu)，這必然導(dǎo)致巨大革命，使得人們發(fā)現(xiàn)許許多多在群體結(jié)構(gòu)研究層次上無(wú)法發(fā)現(xiàn)也無(wú)法理解的大量規(guī)律。

　　注意這里強(qiáng)調(diào)的是單分子“高分辨率”結(jié)構(gòu)，而不僅僅是單分子結(jié)構(gòu)。單分子結(jié)構(gòu)我們目前可以使用比如冷凍斷層成像(cryoET)的手段獲得，但是分辨率非常低，在如此低分辨率情況下，別說(shuō)個(gè)體差異，很多群體結(jié)構(gòu)差異都值得嚴(yán)重質(zhì)疑。或許冷凍電鏡技術(shù)若干年以后會(huì)實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，或許永遠(yuǎn)都不可能，或許這個(gè)目標(biāo)被另外一個(gè)全新的技術(shù)徹底取代，冷凍電鏡從此退出歷史舞臺(tái)。

　　冷凍電鏡：一個(gè)高度交叉的學(xué)科

　　冷凍電鏡領(lǐng)域一直是多學(xué)科高度交叉和相互促進(jìn)才誕生的一個(gè)奇跡。數(shù)學(xué)、物理、化學(xué)、材料、計(jì)算機(jī)、軟件、機(jī)械及自動(dòng)化、精密儀器儀表等等缺一不可，當(dāng)然最終的核心是生命科學(xué)(作者注：此處僅從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度分析，并非泛指一般意義上生命科學(xué)是一切學(xué)科的核心)。生命科學(xué)提出問(wèn)題，其它所有學(xué)科相互結(jié)合產(chǎn)生更好的解決方案。通過(guò)這些解決方案，發(fā)現(xiàn)更多神秘的生命現(xiàn)象，從而提出新的問(wèn)題，誕生新的技術(shù)。

　　舉個(gè)例子，冷凍電鏡圖像信噪比極低，沒(méi)有科學(xué)家的雄心勃勃，沒(méi)有大批信號(hào)分析、圖像處理甚至數(shù)學(xué)家的參與是不可能完成這樣艱巨的任務(wù)。同時(shí)冷凍電鏡領(lǐng)域的一些發(fā)現(xiàn)或需求，也為其它領(lǐng)域的科學(xué)家提供靈感來(lái)源和新的研究思路。MRC-LMB作為現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)源地和近兩年來(lái)飛速發(fā)展的冷凍電鏡技術(shù)核心研究機(jī)構(gòu)，其一大特點(diǎn)就是多學(xué)科“零距離交叉”。從半個(gè)世紀(jì)前的DNA雙螺旋模型、肌紅蛋白晶體結(jié)構(gòu)等到近兩年冷凍電鏡技術(shù)革命，一直將這一理念體現(xiàn)得淋漓盡致。技術(shù)的發(fā)展和重大科學(xué)問(wèn)題的解決幾乎都是同時(shí)進(jìn)行的，當(dāng)然科學(xué)問(wèn)題或應(yīng)用價(jià)值始終是核心和最終驅(qū)動(dòng)力，脫離科學(xué)和應(yīng)用需求的技術(shù)發(fā)展是沒(méi)有意義的。

　　另外一個(gè)比較具體的例子是筆者此前思考過(guò)的一個(gè)問(wèn)題。在電鏡領(lǐng)域出現(xiàn)直接電子探測(cè)設(shè)備之后，MRC-LMB的兩臺(tái)高端電鏡，每天產(chǎn)生5到10T 的數(shù)據(jù)量，近期正在調(diào)試第三臺(tái)，也許不久的將來(lái)，超大數(shù)據(jù)、超快速度電鏡就會(huì)投入生產(chǎn)，這些將會(huì)導(dǎo)致全世界各個(gè)研究機(jī)構(gòu)普遍出現(xiàn)一個(gè)嚴(yán)重的技術(shù)問(wèn)題，就是如何高效、無(wú)損、快速地進(jìn)行數(shù)據(jù)壓縮存儲(chǔ)和數(shù)據(jù)處理，當(dāng)然這里的無(wú)損是相對(duì)特定生物樣品和特定目標(biāo)分辨率而言。這或許會(huì)引起一些信號(hào)處理和圖像壓縮方面的研究人員的興趣。

　　隨著冷凍電鏡對(duì)生物大分子復(fù)合物高分辨率結(jié)構(gòu)研究趨于成熟，更加復(fù)雜的動(dòng)態(tài)機(jī)理研究是必然趨勢(shì)，這是冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展的一個(gè)潛在可能性。但是復(fù)雜生物體系的深入研究需要解決一系列數(shù)學(xué)理論、物理、計(jì)算難題，有的可能甚至超出了這些學(xué)科目前的研究范疇。近些年比較現(xiàn)實(shí)可行的是通過(guò)冷凍電鏡手段，對(duì)特定蛋白復(fù)合物非隨機(jī)情況下的高分辨連續(xù)動(dòng)態(tài)構(gòu)象進(jìn)行分析。筆者認(rèn)為，專(zhuān)業(yè)數(shù)學(xué)家的參與會(huì)大大加速冷凍電鏡技術(shù)在這些方面的發(fā)展。

　　生命體高度復(fù)雜，充滿(mǎn)很多未知的和未被闡述清楚的規(guī)律，這里面有成千上萬(wàn)的生物大分子復(fù)合物，每一個(gè)復(fù)合物又與其它若干分子或復(fù)合物相互作用、相互影響，深入再深入地理解生命本質(zhì)一直都會(huì)是冷凍電鏡的重要方向。冷凍電鏡是強(qiáng)大的基礎(chǔ)研究手段，它通過(guò)解析高度復(fù)雜的生物大分子結(jié)構(gòu)，幫助人們更好地理解生命規(guī)律，從而影響生命科學(xué)相關(guān)的一切下游學(xué)科和技術(shù)，當(dāng)然也包括更好的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)藥物、醫(yī)療診斷等具體應(yīng)用。我們期待在不久的將來(lái)，冷凍電鏡技術(shù)會(huì)對(duì)科學(xué)研究和社會(huì)發(fā)展等方方面面都產(chǎn)生巨大影響。