引言
一提到分子診斷,人們自然會想到核酸和基因。的確,分子診斷技術(shù)的發(fā)展與分子生物學(xué)的研究是分不開的,自1953年Watson和Crick發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來,一系列分子生物學(xué)新技術(shù)相繼出現(xiàn),如Sanger測序、放射性核素和非放射性核素標(biāo)記技術(shù)、電泳、層析、核酸純化、核酸液相和固相雜交、基因工程技術(shù)、限制性酶切、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)、毛細(xì)管電泳、實(shí)時熒光PCR、基因芯片、質(zhì)譜、新一代測序等。這些技術(shù)為臨床分子診斷手段的發(fā)展提供了源源不斷的動力和無限的想象空間,并在應(yīng)用中不斷地成熟,使得臨床分子診斷成為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)最有活力一個的領(lǐng)域,是當(dāng)今個體化醫(yī)療迅速發(fā)展的支撐,其具體表現(xiàn)形式就是各種用于特定疾病診斷和治療的臨床分子診斷試劑。
一、歷史
我國的臨床分子診斷試劑的出現(xiàn),最早可以回溯到上世紀(jì)80年代,較國外晚10年左右,當(dāng)時國外主要用于遺傳病的診斷,我國則主要用于乙型肝炎等傳染病的檢測,這與我國人群乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染率高,乙型肝炎患者較多是分不開的。那時,主要是采用硝酸纖維素膜上斑點(diǎn)雜交方法,探針采用32P標(biāo)記,雜交完成后,通過放射自顯影顯示結(jié)果,后來,逐步發(fā)展到采用生物素或地高辛等非同位素標(biāo)記。上世紀(jì)90年代以前,在我國涉及乙型肝炎治療的醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用核酸斑點(diǎn)雜交檢測HBV DNA相當(dāng)普遍。斑點(diǎn)雜交技術(shù)的特點(diǎn)是簡單方便,但檢測敏感性低,今天看來,將其用于對檢測靈敏度要求較高的病原體的檢測并不合適。1983年,美國Cetus公司的Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),其利用DNA高溫變性和低溫復(fù)性的基本原理,通過變性、復(fù)性和延伸3個溫度變化,成功實(shí)現(xiàn)了DNA在體外的復(fù)制。但該技術(shù)最初由于每一擴(kuò)增循環(huán)均需加入DNA聚合酶(因其不耐熱),實(shí)際應(yīng)用受到限制,成為PCR應(yīng)用于疾病診斷的瓶頸,隨后幾年,該公司成功從美國黃石國家公園溫泉中分離到的嗜熱菌中得到了耐熱的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶),1989年被美國Science雜志命名第一個“年度分子”使PCR臨床應(yīng)用的瓶頸問題迎刃而解,從而使得PCR成為臨床分子診斷和生命科學(xué)研究中的一個革命性技術(shù),預(yù)示著分子時代的到來。因此到90年代初期,國內(nèi)一批研究人員迅即將這一技術(shù)用于HBV的臨床檢測,出現(xiàn)一大批生產(chǎn)PCR試劑的公司,采用的基本技術(shù)是PCR-瓊脂糖凝膠電泳方法,靶核酸經(jīng)PCR擴(kuò)增后,會出現(xiàn)一定長度片段的特異擴(kuò)增產(chǎn)物,電泳分離后,經(jīng)溴化乙啶染色,紫外線下可見相應(yīng)的分子大小的條帶。到90年代中期,又有一些廠家,生產(chǎn)了PCR-板上雜交即PCR-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法。但由于PCR-瓊脂糖凝膠電泳和PCR-ELISA均為PCR后有一個開管取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析的過程,極容易出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物被“污染”所致的假陽性結(jié)果,臨床反映強(qiáng)烈,直接導(dǎo)致1998年4月衛(wèi)生部下文暫停了PCR檢驗(yàn)在臨床中的應(yīng)用。其實(shí)在90年代中期,國內(nèi)一些企業(yè)已意識到這種假陽性帶來的問題,開始研發(fā)實(shí)時熒光PCR檢測試劑,并用于臨床檢測。
二、現(xiàn)狀及問題
臨床檢驗(yàn)的發(fā)展方向無疑是自動化,臨床分子診斷亦是如此。自動化帶來了“檢測系統(tǒng)”的概念,即檢測儀器、試劑和校準(zhǔn)品的一體化,從而避免了同一試劑在不同實(shí)驗(yàn)室配不同儀器所帶來的結(jié)果不確定的問題,但由于我國整體工業(yè)水平(尤其是原材料工業(yè)和精密加工工業(yè))與西方發(fā)達(dá)國家的差距,在國產(chǎn)儀器設(shè)備的基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)臨床檢驗(yàn)的自動化尚需時日,臨床分子診斷尤甚。因此,目前我國的臨床分子診斷在核酸提取、擴(kuò)增反應(yīng)液準(zhǔn)備、擴(kuò)增前加樣、上機(jī)、產(chǎn)物分析和結(jié)果分析報告等方面仍是以手工操作為主。
分子診斷中繁雜且要求精細(xì)的手工操作步驟,使得臨床實(shí)驗(yàn)室工作人員總在不斷追求操作步驟簡單的試劑,試劑生產(chǎn)廠家為滿足用戶的這種需求,也在努力追求操作簡單化,于是一些只需要簡單核酸提取或不需核酸提取、最少試劑配制的檢測試劑應(yīng)時而生。如目前在國內(nèi)廣泛使用的HBV DNA實(shí)時熒光PCR試劑。任何一件產(chǎn)品,如果生產(chǎn)過程只是追求簡單,則一定會以質(zhì)量下降為代價。因此,國內(nèi)的用于傳染病檢測的PCR試劑如HBV DNA、丙型肝炎病毒RNA(HCV RNA)和人類免疫缺陷病毒-1 RNA(HIV-1 RNA)定量檢測,與國外同類試劑盒相比較,一直存在重復(fù)性、分析敏感性和抗干擾(溶血、黃疸、脂血等)能力差等問題[1,2,3]。存在這些問題的最根本原因主要在于核酸提取,熒光PCR擴(kuò)增階段的試劑水平與國外并無太大差距。臨床標(biāo)本中可能存在血紅蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、膽紅素、血脂等均是PCR擴(kuò)增反應(yīng)的抑制劑,是否能有效地將這些抑制物從標(biāo)本中去除,決定了后續(xù) 的PCR擴(kuò)增效率。核酸提取方法過于簡單,則無法將這些抑制物有效去除,直接影響后面的擴(kuò)增檢測結(jié)果,影響上述檢測性能。而且,也因?yàn)檫@些抑制物的存在,無法在擴(kuò)增檢測時加大樣本加入量。樣本加入量小,一是加樣的重復(fù)性和準(zhǔn)確性都相對較差,最后會反映在整個檢測的重復(fù)性差;二是直接影響分析敏感性。作為PCR擴(kuò)增來說,從理論上講,每個反應(yīng)管內(nèi)至少有1個分子,才會出現(xiàn)擴(kuò)增,加樣量少,在標(biāo)本內(nèi)相應(yīng)靶核酸含量少的情況下,則取得1個以上靶分子的可能性也小,反之越大。相對于傳染性病原體核酸檢測來說,人的基因檢測試劑在上述方面問題相對較少,因?yàn)槿说幕蚝扛?一般不存在因標(biāo)本中基因組含量少而影響檢測敏感性的問題,通常的核酸提取方法均可達(dá)到相應(yīng)要求。
近年來,隨著藥物基因組學(xué)和腫瘤靶向治療等的研究進(jìn)展,與個體化治療用藥相關(guān)的基因多態(tài)性、基因突變和基因量的變化等的檢測正迅速走向臨床應(yīng)用。國內(nèi)眾多廠家正在采用各種方法開發(fā)商品試劑,如基于實(shí)時熒光PCR的方法、PCR-雜交(硝酸纖維素膜、乳膠顆粒如Luminex、玻片如基因芯片等)、PCR-測序(雙脫氧測序、焦磷酸測序、新一代測序如Illumina、Ion torrent等)和PCR-高分辨熔點(diǎn)曲線分析(HRM)等,技術(shù)多種多樣,各有特點(diǎn),有的對實(shí)驗(yàn)室分區(qū)和操作人員的要求較高,對廣大基層實(shí)驗(yàn)室來說,較難實(shí)際應(yīng)用。因此,作為臨床實(shí)驗(yàn)室如何判斷一種試劑方法能否有效地用于日常檢測,最重要的是在自己實(shí)驗(yàn)室條件,對相應(yīng)的試劑方法進(jìn)行性能驗(yàn)證,主要的性能指標(biāo)有重復(fù)性、準(zhǔn)確性、特異性、檢測限和抗干擾能力等,這些性能指標(biāo)中最重要的是重復(fù)性,其是準(zhǔn)確性的前提。評價重復(fù)性的1個簡單方法是,選擇不同強(qiáng)弱陽性及陰性的數(shù)份樣本進(jìn)行20次批內(nèi)和批間測定,看是否能得到相同的結(jié)果。如否,需尋找原因,排除實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件及人員操作的因素,如果確認(rèn)屬于試劑或方法的問題,則該試劑或方法就不具備臨床實(shí)用性,不能用于臨床檢測。
三、展望
隨著對人類基因及其結(jié)構(gòu)改變、基因表達(dá)或表達(dá)產(chǎn)物代謝異常與疾病的發(fā)生、發(fā)展和藥物作用上的研究進(jìn)展,分子診斷不只是涉及DNA和RNA,也涉及蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)檢測。檢測方法學(xué)的進(jìn)步,使得因疾病而改變的基因及其結(jié)構(gòu)改變的譜、基因表達(dá)譜(RNA和蛋白譜)、代謝通路上的小分子譜的檢測變得容易,將出現(xiàn)一大批可用于臨床疾病診治的分子診斷標(biāo)志物,使人類對疾病的認(rèn)識,由點(diǎn)入面,最后得到1個清晰的全景圖像,治療成為有的放矢,使得患者疾病的治療進(jìn)入到真正的個體化時代。 由上述可見,實(shí)驗(yàn)室檢測尤其是分子診斷的準(zhǔn)確性對于個體化醫(yī)學(xué)時代患者疾病的診治的重要意義。
1.方法學(xué)的更新?lián)Q代
2.商品試劑與實(shí)驗(yàn)室自配試劑
我國的臨床檢驗(yàn)由完全的自配試劑進(jìn)行日常檢測進(jìn)入到依賴商品試劑盒,是從上世紀(jì)80年代末開始的,到90年代中后期,實(shí)驗(yàn)室基本不再使用自配試劑。分子診斷不同于臨檢、生化、一般免疫分析等,其日常檢測量明顯較少,且一些特定的檢測項(xiàng)目如遺傳病和罕見疾病的分子診斷,病例數(shù)更少,這些疾病的分子診斷試劑是永遠(yuǎn)也不可能有經(jīng)過批準(zhǔn)的商品試劑盒的,因此,就必須允許臨床實(shí)驗(yàn)室自配試劑進(jìn)行檢測。最重要的是,如果是自配試劑必須有自配試劑的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP),包括從原材料選擇及其每批質(zhì)檢、試劑配制、試劑的性能驗(yàn)證(重復(fù)性、準(zhǔn)確性、特異性、檢測下限、抗干擾能力等)、每批試劑質(zhì)檢方法等,最后形成的應(yīng)是一個非商品試劑盒,從內(nèi)到外應(yīng)有商品試劑盒所具備的所有必要成分,并標(biāo)明有效期。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存該試劑制備的所有原材料購置、質(zhì)檢和制備的實(shí)驗(yàn)記錄。用于日常檢測時,應(yīng)有嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)量控制,如有室間質(zhì)量評價,則應(yīng)參加,如無,則應(yīng)有實(shí)驗(yàn)室間比對,以保證日常檢驗(yàn)的質(zhì)量。
3.實(shí)驗(yàn)室檢測的自動化
隨著我國基礎(chǔ)工業(yè)的進(jìn)步及下游工業(yè)的全球化,臨床分子診斷的自動化將逐步在國內(nèi)的臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。自動化首先將是在目前手工操作且對結(jié)果影響最大的核酸提取上實(shí)現(xiàn),然后是結(jié)果的分析判斷,這方面軟件將起到最為關(guān)鍵的作用。當(dāng)然最終目標(biāo),是實(shí)現(xiàn)從核酸提取到擴(kuò)增檢測、結(jié)果報告全過程的自動化,國外一些廠家如羅氏、凱杰已實(shí)現(xiàn)了這一點(diǎn),但對于國內(nèi)企業(yè)來說,仍需要一個相當(dāng)長的時間。
