要先對PCR目的序列長度要有大致估計：

第一步：找到Primer3站點，你不用記住這個站點，但是要記住“Primer3”這個詞，然后打開GOOGLE首頁，輸入Primer3，跳出來的第一個項目就是了“Primer3 Input 0.4.0(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”網址：http://frodo.wi.mit.edu          

第二步：貼上模板序列。進入Primer3站點，可以看到一個引物設計的界面。（附件：Word文檔里有圖）在“Paste source sequence below(5'->3'…..”下面的大空框里將你的模板序列粘帖進去。注意是5'->3'方向的，數(shù)字或者空格都沒關系，軟件會自動過濾。

第三步：重要參數(shù)設定。首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望軟件給你隨便做的話，首先要調整的就是這個參數(shù)。默認的參數(shù)實際上是從100到1000，這個你得自己改，如果你希望產物的大小符合你的預期，盡可能把范圍改小，比如：480～500，具體看情況調整。第二個參數(shù)是“Primer Size”，默認值一般可以用，但是，當你用熟了這個軟件，你自己就知道該怎么改了。第三個參數(shù)是“PrimerTm”這個和Primer Size差不多。

第四步：Pick primers：點一下這個按鈕，符合你大小預期的primer就出來了，看看Primer3Output的界面，多么漂亮！你要的primer出來了，而且有primer在序列上的位置比對圖，還要primer本身的信息，包括：位置、長度、Tm、GC含量、任何位置互補堿基數(shù)、3'端互補堿基數(shù)以及引物序列（注意：下游引物是5'->3'），還要看產物大小，兩引物間任意互補堿基數(shù)，兩引物間3'端互補堿基數(shù)等。如果引物尚在參數(shù)設定的范圍內，但還不是最佳，將會給出警告。

第五步：引物設計檢驗：可以僅設計一向引物，只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一個就可以。也可以自己定義引物，放在Primer框里（注意：下游引物書寫反向仍然是5'->3'）如果符合設定條件，軟件將對給出引物評分，同時給出警告信息，根據(jù)警告信息可以適當對自定義引物做些調整即可，警告信息也讓你做實驗的時候心中有數(shù)。對于文獻發(fā)表的引物，最好檢查一下，這樣就可以避免被別人有意無意誤導。至于RT-PCR所用引物，最好使得產物跨過內含子，這樣避免潛在DNA對RT-PCR干擾。實際做引物的時候，要把內含子都去掉，僅將外顯子序列放入源序列框中，并且，通過自定義引物設計的方法，使上下游引物分別全部或者部分落在不同外顯子上。

至于設計出來引物的實際效果，根據(jù)我的經驗，一般情況下都能做到PCR一次成功，也許隨便那一段序列做引物也能達到很好的效果，但是不管怎么說，軟件做引物可以讓自己心中有數(shù)。

增加PCR特異性：

1.primers design

這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：

1)足夠長，18～24bp，以保證特異性，當然，不是說越長越好，太長的primer同樣會降低特異性，并且降低產量；

2)GC%，40%~60%；

3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性；

4)避免3'端GCrich，最后3個base不要有GC，或者最后5個有3個不要是GC（有人說：3'端最好是GC/CG/CC/GG。)；

5)避免3'端的互補，否則，容易造成DIMER；

6)避免3'端的錯配；

7)避免內部形成二級結構；

8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時不算，但在檢測互補和二級結構要加上它們；

9)使用兼并primer時，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；

10)最好學會使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，online design et al.

*primer的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當50％的primer和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度，Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證primer同目的序列有效退火。同時，還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比primer的Tm低5℃。

設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于：小于18堿基的primer。

有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定primerTm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰堿基特性預測primer的雜交穩(wěn)定性，大部分計算器程序使用近鄰分析法。

根據(jù)所使用的公式及primer序列不同，Tm會差異很大。因為，大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點?？梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少primer二聚體和非特異性產物形成。

為獲得最佳結果，兩個primer應具有近似的Tm值。primer對的Tm差異如果超過5℃，就會primer在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個primer Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃，或者，為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設計的退火溫度進行剩余循環(huán)。使得在較為嚴謹?shù)臈l件下可獲得目的模板部分拷貝。

stability of primers：定制primer標準純度對于大多數(shù)PCR應足夠。

primer產量受合成化學效率及純化方法影響。定制primer以干粉形式運輸。最好在TE重溶primer，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為，水的pH經常偏酸，會引起寡核甘的水解。primer的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的primer儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的primer在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉primer可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。

PCR檢測微量感染因子時，容易因為污染的而導致各種問題，因此，進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染出現(xiàn)。

（1）劃分操作區(qū)：

目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內進行：
①標本處理區(qū)，包括：擴增摸板制備；
②PCR擴增區(qū)，包括：反應液的配制和PCR擴增；
③產物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆制備。
※各工作區(qū)要具有一定隔離，操作器材專用，要有一定方向性，如，標本制備→PCR擴增→產物分析→產物處理。
切記：產物分析區(qū)的產物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。

（2）分裝試劑：

PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝，所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源DNA：
①PCR用水應為高壓的雙蒸水；
②引物和d-NTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區(qū)配制；
③引物和d-NTP應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發(fā)生污染時查找原因；

（3）實驗操作注意事項：

盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。

因此：不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應該注意：
①戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；
②使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；
③避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；
④操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度；
⑤最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管；
⑥操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性；
⑦盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如，沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)；
⑧重復實驗，驗證結果，慎下結論。

什么是PCR實驗靈敏度?

靈敏度指的是PCR擴增反應能夠檢測到目的基因最小值。研究結果表明，影響PCR擴增效率的因素，如，模板的復雜程度與完整性、引物純度及其與模板結合效率、反應溫度、DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性與擴增性能、反應緩沖液的離子組成（主要指：陽離子）、反應優(yōu)化劑等，均決定PCR實驗檢測靈敏度。在最佳擴增條件下，常規(guī)PCR反應能夠檢測到pg(10～12g)數(shù)量級目的基因。對于一個特定的目的基因，模板與引物通常都是已經限定好的因素。因此，選擇什么樣的PCR反應體系（包括：DNA聚合酶與反應緩沖液等）就是研究者提高PCR實驗靈敏度的關鍵因素了。
與實驗室自配PCR擴增體系相比，東盛Taq Mix對反應緩沖液中的成分進行優(yōu)化，并加入了適當比例的反應增強劑（PCR Enhancer），提高DNA聚合酶熱穩(wěn)定性，顯著降低模板二級結構對PCR擴增性能影響，使得DNA聚合酶處于最適活性狀態(tài)，從而獲得比自配體系更高檢測靈敏度。即時反應體系中只有幾個目的基因拷貝，也能輕松檢測。

什么是PCR實驗特異性？
特異性指的是在PCR擴增過程中，專一性擴增目的片段而非其他片段的性能。在PCR實驗本身的靈敏度很高，且實驗條件未充分優(yōu)化的情況下，通常會在目的片段出現(xiàn)同時伴隨有其他雜帶，即，發(fā)生非特異性擴增現(xiàn)象。模板、引物性質及質量、反應條件控制等均會影響PCR擴增特異性。近年，研究結果表明，緩沖液品質（如，離子種類與組成，反應優(yōu)化劑等）對保證PCR特異性擴增起著不可忽視的作用。一般緩沖液中調節(jié)氫鍵作用鹽只有KCl，而東盛HSTMTaq Mix的緩沖體系通過反應優(yōu)化劑以及KCl/(NH₄)SO₄鹽離子體系平衡調節(jié)，顯著提高PCR擴增特異性，降低背景。   

PCR實驗靈敏度與特異性是一對此長彼消特性，這也決定我們實驗體系調節(jié)實際上就是需要找到適合實驗靈敏度與特異性平衡點。由于PCR體系中的眾多成分，使得組合較多，篩選工作繁雜。東盛基于靈敏度與特異性分別設計了PCR Mix和HS Taq Mix，幫您確定大平衡點，如果您需要更細致的平衡點，請選擇相應的Mix Kit系列進行微調。