什么是微型化雙光子熒光顯微鏡？

　　成像技術(shù)是推動生命科學(xué)進(jìn)步的核心動力。上世紀(jì)以來，人類陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了包括X射線、全息照相法、CT、電子顯微鏡、MRI磁共振成像、超高分辨率顯微成像在內(nèi)的多種成像技術(shù)。

　　而近年來，生命科學(xué)研究的發(fā)展趨勢從分子與細(xì)胞的層級上升到離體組織與器官、歷經(jīng)在體麻醉動物細(xì)胞顯微到現(xiàn)在的清醒動物的分子與細(xì)胞動態(tài)信號，不斷對成像技術(shù)提出新的要求，即在清醒活體的狀態(tài)下還要保證分子水平的分辨率。

　　主導(dǎo)本次研發(fā)過程的程和平院士團(tuán)隊認(rèn)為，雙光子顯微成像會是解決這個挑戰(zhàn)的一個重要方面。

　　程和平院士

　　據(jù)程院士介紹，雙光子顯微鏡其實(shí)不是新鮮事物，1930年代，M·Goeppert Mayer就提出了雙光子吸收躍遷的基本原理；1960年代，激光器的發(fā)明使得雙光子效應(yīng)被驗證和應(yīng)用；1990年，Denk，Webb發(fā)明了第一臺雙光子顯微鏡，至今已有20多年的歷史。

　　如今，雙光子熒光顯微鏡是活體動物神經(jīng)成像的經(jīng)典方法。雙光子成像本身具有高分辨率、高通量(高速)、非侵入、成像深度大等特點(diǎn)，與熒光蛋白以及熒光染料等標(biāo)記物在細(xì)胞中的定位與表達(dá)技術(shù)相結(jié)合，能夠在生命體和細(xì)胞仍具有活性的狀態(tài)下對其功能進(jìn)行動態(tài)觀察，使得人們可以研究處于生理狀態(tài)時的動物大腦內(nèi)的神經(jīng)元活動。

　　雙光子成像技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)

　　程院士認(rèn)為，盡管雙光子成像有看得準(zhǔn)、看得深、光損傷小等優(yōu)點(diǎn)，但也存在看活體不準(zhǔn)、掃描速度慢、體積龐大無法便攜化等缺點(diǎn)。

　　之前在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，如果科學(xué)家想要對小動物在行為過程中的大腦活動進(jìn)行成像研究，是采用了一種看起來非常好玩而又黑科技的方式。

　　將虛擬現(xiàn)實(shí)與雙光子成像相結(jié)合，在小動物頭部被固定的情況下，在其眼前制造影像，讓動物認(rèn)為自己處在“真實(shí)”的環(huán)境之中，通過動物四肢在類似跑步機(jī)或者鼠標(biāo)滾球上的運(yùn)動來模擬其真實(shí)活動，以求達(dá)到研究神經(jīng)元在動物行為中所起到的作用。

　　但是，這種虛擬現(xiàn)實(shí)加頭部固定成像的方法，已經(jīng)遭到許多科學(xué)家的質(zhì)疑。他們認(rèn)為，頭部被固定會使動物在實(shí)驗期間受到物理約束和情緒的壓力，因此無法證明虛擬現(xiàn)實(shí)下得到的結(jié)果等同于真實(shí)環(huán)境。

　　更重要的是，許多社會行為，比如親子護(hù)理，交配和戰(zhàn)斗，是不能用頭部固定的方式進(jìn)行研究的。如何在動物自由活動的時候，直接對其神經(jīng)元進(jìn)行成像，是神經(jīng)科學(xué)家還未能得到解決終極的訴求。

　　所以，開發(fā)一種微型熒光顯微鏡，讓其直接固定在自由活動的動物身上成為了解決問題的關(guān)鍵。十多年來，人們經(jīng)歷了微型單光子寬場顯微鏡；重達(dá)25克、且成像速度慢的雙光子顯微鏡等階段，一直無法攻克微型雙光子顯微鏡需要解決的諸多技術(shù)難題。

　　新一代微型化雙光子熒光顯微鏡的性能

　　在這樣的背景下，北京大學(xué)聯(lián)合解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成了跨學(xué)科團(tuán)隊，歷經(jīng)三年時間，成功研制出新一代高速高分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，并獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰、穩(wěn)定的圖像。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊 Nature Methods 上。

　　據(jù)悉，新一代微型化雙光子熒光顯微鏡重量僅2.2克，橫向分辨率可達(dá)到0.65微米，成像質(zhì)量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美。采用雙軸對稱高速微機(jī)電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù)，成像幀頻已達(dá)40HZ（256*256像素），同時具備多區(qū)域隨機(jī)掃描和每秒1萬線的線掃描能力。

　　此外，采用自主設(shè)計可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統(tǒng)首次實(shí)現(xiàn)了微型雙光子顯微鏡對腦科學(xué)領(lǐng)域最廣泛應(yīng)用的指示神經(jīng)元活動的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用。同時采用柔性光纖束進(jìn)行熒光信號的接收，解決了動物的活動和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來，與光遺傳學(xué)技術(shù)的結(jié)合，有望在結(jié)構(gòu)與功能成像的同時，精準(zhǔn)地操控神經(jīng)元和神經(jīng)回路的活動。

　　研究意義和價值

　　微型化雙光子熒光顯微成像改變了在自由活動動物中觀察細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方式，可用于在動物覓食、哺乳、跳臺、打斗、嬉戲、睡眠等自然行為條件下，或者在學(xué)習(xí)前、學(xué)習(xí)中和學(xué)習(xí)后，長時程觀察神經(jīng)突觸、神經(jīng)元、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、遠(yuǎn)程連接的腦區(qū)等多尺度、多層次動態(tài)變化。

　　該成果在2016年底美國神經(jīng)科學(xué)年會、2017年5月冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會議上報告后，得到包括多位諾貝爾獎獲得者在內(nèi)的國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)家的高度贊譽(yù)。

　　冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會議主席、美國著名神經(jīng)科學(xué)家加州大學(xué)洛杉磯分校的Alcino J Silva教授在評述中寫道

　　從任何一個標(biāo)準(zhǔn)來看，這款顯微鏡都代表了一項重大技術(shù)發(fā)明，必將改變我們在自由活動動物中觀察細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方式。它所開啟的大門，甚至超越了神經(jīng)元和樹突成像。系統(tǒng)神經(jīng)生物學(xué)正在進(jìn)入一個新的時代，即通過對細(xì)胞群體中可辨識的細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜生物學(xué)事件進(jìn)行成像觀測，從而更加深刻地理解進(jìn)化所造就的大腦環(huán)路實(shí)現(xiàn)復(fù)雜行為的核心工程學(xué)原理。毫無疑問，這項非凡的發(fā)明讓我們向著這一目標(biāo)邁進(jìn)了一步。

　　目前腦科學(xué)的發(fā)展如火如荼，各國腦科學(xué)計劃的一個核心方向就是打造用于全景式解析腦連接圖譜和功能動態(tài)圖譜的研究工具。其中，如何打破尺度壁壘，整合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動與大腦整體的活動和個體行為信息，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

　　該設(shè)備的成功問世對于腦科學(xué)的研究有重大意義，人類探索大腦星辰大海的征程又進(jìn)入一個嶄新的階段。

　　程和平院士團(tuán)隊接受采訪

研究團(tuán)隊接受采訪

　　主題演講結(jié)束后，程和平院士團(tuán)隊接受了雷鋒網(wǎng)等媒體的采訪，以下是采訪實(shí)錄，雷鋒網(wǎng)做了不改變原意的整理：

　　1、提到腦科學(xué)，不得不讓人聯(lián)想到現(xiàn)在很火熱的人工智能。請問目前你們團(tuán)隊所取得的成績可以和人工智能的哪方面研究做對接？

　　程院士團(tuán)隊：目前的人工智能還處于弱人工智能階段，要想實(shí)現(xiàn)強(qiáng)人工智能，還是要像生物腦進(jìn)行學(xué)習(xí)。最簡單的一個模式生物，學(xué)會一件事情或者說一個條件學(xué)習(xí)的過程，只需要半個小時或一個小時就能形成。

　　在這個過程中神經(jīng)的回路正在發(fā)生了什么變化，原來是沒辦法知道的，但是用了我們這些微型化的鏡子，就可以在它們執(zhí)行某個動作的學(xué)習(xí)的過程中看到各個回路不同層次的特性變化。

　　2、現(xiàn)在的顯微鏡技術(shù)和你們新研究出來的技術(shù)有何區(qū)別？新研究的先進(jìn)性體現(xiàn)在哪里？

　　程院士團(tuán)隊：我們的競爭對手是Mark Schnitzer教授，他是美國腦計劃的發(fā)起人，所以我們剛開始也是征詢了他們的意見的。我們和他們最大的不同是在同樣重量的情況下，我們的分辨率更高、而且看的更深。

　　3、這個研究成果在人類大腦的應(yīng)用前景如何？

　　程院士團(tuán)隊：比如，在外科手術(shù)的臨床應(yīng)用上，因為我們可以提供手持式的技術(shù)，當(dāng)需要做開顱手術(shù)的時候，就可以看到腫瘤的邊界和大腦的神經(jīng)活動。

　　4、這項研究的商業(yè)化進(jìn)展如何？

　　程院士團(tuán)隊：目前已經(jīng)有兩個諾貝爾獎獲得者對我們的研究感興趣，想一起合作。說明這個技術(shù)還是很受歡迎的。就像剛才說的，一方面能夠?qū)⒓夹g(shù)封裝為手持式或內(nèi)窺的醫(yī)用設(shè)備，一方面神經(jīng)科學(xué)家需要的那種顯微鏡，一只研究的小鼠頭上就要帶一臺，如果是猴子的話可能要帶幾臺，所以我們認(rèn)為市場還是非常大的。