你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果受到污染的影響了嗎?
生物實(shí)驗(yàn),大多數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)都是微觀的,基于細(xì)胞,分子,蛋白水平,而這些微觀樣本對(duì)外界環(huán)境的影響敏感,比如溫度、ph值、酶解、損傷等,在我們盡力呵護(hù)樣本的生存環(huán)境的同時(shí),污染也是需要注意的頭等大事,要堅(jiān)決避免環(huán)境中的“雜質(zhì)”的亂入,包括樣本污染,試劑儀器交叉污染、產(chǎn)物氣溶膠污染等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。“易查不易察”,污染來(lái)的悄無(wú)聲息,防不勝防,假陽(yáng)性結(jié)果讓無(wú)數(shù)生物學(xué)子抓狂和崩潰。
小編今天就來(lái)扒一扒生物實(shí)驗(yàn)室污染之PCR實(shí)驗(yàn)污染你不知道的事
在眾多的生物實(shí)驗(yàn)室,分子生物學(xué)檢測(cè)方法如PCR因其高靈敏度、快速、操作方便等優(yōu)勢(shì)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用,不過(guò)正是由于它靈敏度極高,極微量的污染源都有可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性,所以對(duì)環(huán)境污染的控制也極為嚴(yán)格。面對(duì)眾多的污染源,比如樣本交叉污染、試劑儀器交叉污染、克隆質(zhì)粒污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染、還有極容易忽視的氣溶膠污染,氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系,在空氣與液體面摩擦?xí)r,比如在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管,開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆??珊?8000拷貝,因而由其造成的污染是一個(gè)非常重要而被忽視的污染源。
雖然這些污染對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響已經(jīng)受到了廣泛重視,多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)污染控制都采取了各種辦法,比如定期大掃除清理、劃分操作區(qū)域、試劑分裝、操作謹(jǐn)慎、重復(fù)實(shí)驗(yàn)、多角度驗(yàn)證結(jié)果。但是微量的核酸片段就能被擴(kuò)增,所以對(duì)污染物的控制不僅僅是做到這些就能夠杜絕和避免的,關(guān)鍵是需要從源頭控制。目前多數(shù)生物試驗(yàn)室,分子實(shí)驗(yàn)每天都在大規(guī)模進(jìn)行,污染源已經(jīng)無(wú)處不在,特異性的,非特異性的,同源的,非同源的,廣泛分布在樣本容器、實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面,試劑溶液中、儀器表面內(nèi)管附著等等,你以為普通的清理就能解決這些污染源嗎?必須是不行的,實(shí)驗(yàn)室大拿們都為了清除這些污染源研究出好多種方法,整理跟大家共享。
合理的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)
實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)用品,包括移液器等應(yīng)專(zhuān)用。如有可能,應(yīng)在裝有紫外燈的層流式工作臺(tái)(如生物安全柜、超凈工作臺(tái))內(nèi),吸加PCR試劑,工作臺(tái)內(nèi)應(yīng)放置PCR專(zhuān)業(yè)用的微量離心機(jī)、一次性手套、各量程的移液器和其他必須物品。
正確的實(shí)驗(yàn)操作
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吸加PCR試劑和模板的操作應(yīng)嚴(yán)格按要求進(jìn)行,吸樣要慢,盡量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。
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實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中應(yīng)勤換手套,在進(jìn)出不同區(qū)域或進(jìn)行模板操作后,都應(yīng)及時(shí)更換手套。
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裝有PCR試劑的微量離心管在打開(kāi)之前應(yīng)先做瞬時(shí)離心(約10s),將管壁及管蓋上的液體甩至管底部,從而減少污染手套或加樣器的機(jī)會(huì)。開(kāi)管動(dòng)作要輕,以防管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠,造成污染。
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在同時(shí)進(jìn)行多個(gè)PCR反應(yīng)時(shí),應(yīng)制備主反應(yīng)混合液,再分裝至PCR反應(yīng)管,最后添加樣品核酸模板,以減少單個(gè)添加操作繁瑣造成的污染。
實(shí)驗(yàn)器具和試劑
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實(shí)驗(yàn)室自己配置的試劑,如去離子水、緩沖液等,在使用之前均應(yīng)高壓滅菌或過(guò)濾除菌。
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分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝,以減少重復(fù)取樣次數(shù),并置于-20℃保存,適當(dāng)時(shí),最好做到專(zhuān)人專(zhuān)用。另外,PCR試劑、PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開(kāi)保存,不應(yīng)放于同一冰盒或冰箱。
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所有吸頭、反應(yīng)管等應(yīng)一次性使用,使用之前,都應(yīng)經(jīng)過(guò)高壓處理。若條件允許,最好使用帶濾器的槍頭。各工作區(qū)內(nèi)的移液器要有標(biāo)識(shí),應(yīng)固定使用用途,不能交叉使用。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的相關(guān)規(guī)定,實(shí)驗(yàn)中至少應(yīng):
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設(shè)置目標(biāo)DNA陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)。對(duì)靶序列所作的適當(dāng)?shù)南♂尮ぷ鲬?yīng)于實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)別的位置進(jìn)行,這樣可防止將靶DNA的濃溶液帶到實(shí)驗(yàn)室中專(zhuān)門(mén)進(jìn)行PCR的位置。
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設(shè)置PCR試劑陰性對(duì)照和目標(biāo)DNA陰性對(duì)照反應(yīng)。