DNA復(fù)制起始在真核生物細(xì)胞體中受到嚴(yán)格精密調(diào)控。DNA復(fù)制啟動(dòng)因子首先結(jié)合到DNA復(fù)制起點(diǎn)，以加載DNA復(fù)制解旋酶MCM2-7復(fù)合物到DNA上，隨后MCM2-7被激活，DNA雙鏈被解螺旋，從而啟動(dòng)DNA復(fù)制。真核生物的復(fù)制啟動(dòng)因子ORC由六個(gè)亞基組成。所有真核生物都是利用ORC來標(biāo)記DNA復(fù)制起始的位點(diǎn)。除了在基因組穩(wěn)定性以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中顯而易見的重要作用，人源 ORC復(fù)合物的多個(gè)亞基（包括ORC1，ORC4，ORC6，Cdc6）的功能缺失突變都和一類罕見遺傳發(fā)育疾病直接相關(guān)（Meier-Gorlin syndrome，MGS）。MGS患者在胚胎期生長(zhǎng)遲緩并伴隨多種發(fā)育畸形，出生后發(fā)育也嚴(yán)重受阻并導(dǎo)致身材矮小、小耳癥、膝蓋骨缺失等。

　　雖然在不同的真核生物中，ORC的蛋白質(zhì)序列高度保守，但是ORC對(duì)DNA復(fù)制起點(diǎn)序列的選擇性在不同物種間差別很大。釀酒酵母的ORC可以識(shí)別特異的DNA復(fù)制起點(diǎn)，而人源細(xì)胞的ORC結(jié)合的DNA序列卻沒有序列特異性，主要依賴染色體結(jié)構(gòu)識(shí)別復(fù)制起點(diǎn)。ORC序列識(shí)別差異背后的分子機(jī)制，也一直是個(gè)未解之謎。造成這種局面的一個(gè)很大的原因，就是多年來一直缺少ORC結(jié)合DNA的高分辨結(jié)構(gòu)。已經(jīng)發(fā)表的關(guān)于ORC結(jié)構(gòu)中，要么復(fù)合物中沒有DNA，要么分辨率較低，不足以提供足夠的細(xì)節(jié)信息，我們?nèi)匀粺o法推測(cè)ORC與DNA是如何相互作用從而實(shí)現(xiàn)其功能的。為了解開這個(gè)謎團(tuán)，高寧課題組和戴碧瓘課題組克服一些技術(shù)難題，合作解析了釀酒酵母ORC結(jié)合DNA復(fù)制起始位點(diǎn)3-分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。

　　（a）ORC-起點(diǎn)DNA復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)；（b）復(fù)合物結(jié)構(gòu)中DNA在ACS以B1區(qū)域的兩次彎曲

　　本文解析的ORC-ARS305 DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，ARS305包含一段ARS高度保守序列（ARS consensus sequence， ACS）和一段B1元件序列，長(zhǎng)度為72 bp。在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，ORC的六個(gè)亞基通過與磷酸骨架的非特異性以及與堿基的特異性相互作用環(huán)繞DNA，并在ACS和B1位點(diǎn)使DNA發(fā)生彎曲。該結(jié)構(gòu)的一個(gè)關(guān)鍵特征是Orc1的保守堿性氨基酸區(qū)域（Orc1-BP，basic patch）深深地插入ACS的小溝中進(jìn)行序列特異的堿基識(shí)別。另外，酵母特有的具有物種特異性的位于Orc4 Wing Helix結(jié)構(gòu)域（WHD）中的Helix Insertion（Orc4-IH）嵌入ACS的大溝中，與相應(yīng)的堿基形成疏水相互作用。重要的是，在ACS區(qū)域形成的這些堿基特異的相互作用的堿基都非常保守。此外，在B1區(qū)域中，也有類似的來自O(shè)rc2和Orc5的堿性氨基酸區(qū)域插入到大溝和小溝中，與堿基相互作用，并使DNA彎曲。因此，釀酒酵母ORC高度序列特異性主要是通過ORC亞基的大溝、小溝插入基序與ACS保守堿基之間的特異性相互作用實(shí)現(xiàn)的。序列比對(duì)分析顯示，所有真核生物Orc1的N端都具有類似釀酒酵母的Orc1-BP；然而Orc4-IH卻只在釀酒酵母中存在。這些發(fā)現(xiàn)，很大程度上解釋了不同物種ORC識(shí)別起始DNA特異性差異背后的原因。

　　高寧以及戴碧瓘、香港科技大學(xué)翟元樑博士（現(xiàn)為香港大學(xué)助理教授）為本文的共同通訊作者。高寧組的博士后李寧寧、博士生程稼萱以及戴碧瓘組的博士后林偉熙、翟元樑為本文的共同第一作者。高寧組的成二超（2017年已博士畢業(yè)）和戴碧瓘組的博士趙永倩參與了研究工作。冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集工作主要在北京大學(xué)電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)室（冷凍電鏡平臺(tái)）完成，平臺(tái)的李雪梅老師和物理學(xué)院的余大啟博士在數(shù)據(jù)收集過程中提供幫助；國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)（北京）設(shè)施清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)為本課題的早期研究提供支持。冷凍電鏡數(shù)據(jù)處理主要在北京大學(xué)高性能計(jì)算中心完成，平臺(tái)主管樊春老師亦提供幫助。本論文得到科技部、國(guó)家自然科學(xué)基金委、香港研究資助局、中國(guó)博士后基金的經(jīng)費(fèi)支持。李寧寧獲得北京大學(xué)-清華大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心優(yōu)秀博士后基金的資助。

　　高寧課題組和戴碧瓘課題組從2013年開始合作，在真核生物DNA復(fù)制起始調(diào)控機(jī)制的研究方面取得了很好的成果。他們先后解析了酵母DNA復(fù)制解旋酶雙六聚體復(fù)合物Mcm2-7的3.8-的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（Nature，2015）以及解旋酶加載到DNA前游離的Mcm2-7六聚體和Cdt1-Mcm2-7七聚體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)（Nat Struct&Mol Biol， 2017）。

　　值得一提的是，這是北京大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)自2017年秋季正式運(yùn)行以來，其產(chǎn)出的研究成果首次在國(guó)際頂級(jí)期刊上發(fā)表。ORC-DNA復(fù)合物的分子量為400kD左右，顆粒較小，分辨率可以達(dá)到3？，這表明北京大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)的硬件建設(shè)的初步目標(biāo)已經(jīng)圓滿達(dá)成。