人體內(nèi)多囊蛋白的突變會引發(fā)多囊腎病,每千人中大約有1—2.5人患病,算比較常見。2003年一篇題為《常染色體顯性遺傳性多囊腎病研究的熱點(diǎn)問題》的論文中顯示,該病的研究熱點(diǎn)在于致病基因表達(dá)產(chǎn)物,即多囊蛋白1和多囊蛋白2的結(jié)構(gòu)與功能、亞細(xì)胞定位等,這樣可闡明多囊腎病的分子發(fā)病機(jī)制,有望實(shí)現(xiàn)臨床徹底治愈。
15年后,該蛋白家族的精細(xì)結(jié)構(gòu)終于解出,完成“忘年問答”。識得該蛋白家族的“廬山真面目”難在多囊蛋白1擁有4302個氨基酸,包含11次跨膜螺旋,是一個超復(fù)雜的蛋白;同時(shí)多囊蛋白1與多囊蛋白2還會復(fù)合,增加了結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。
系統(tǒng)摸索,獲得足夠的測試用量
“解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的第一步是獲得足夠量且性質(zhì)均一的蛋白質(zhì)。”8月11日,論文作者之一的王廷亮博士告訴科技日報(bào)記者,“上鏡”前的準(zhǔn)備工作耗時(shí)5年。
對于結(jié)構(gòu)生物學(xué)家來說,測試蛋白經(jīng)常在量上“捉襟見肘”。蛋白質(zhì)為人源蛋白,很難直接從人體組織中富集提取而出。研究團(tuán)隊(duì)通過已知的基因序列將基因在原核生物中(例如大腸桿菌)進(jìn)行克隆,獲得大量基因拷貝后,通過病毒侵染的方法轉(zhuǎn)入到常用的工具細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),富集目標(biāo)蛋白質(zhì)。
為了讓外來基因在“新環(huán)境”中表達(dá),研究組進(jìn)行大量重復(fù)性工作,為目標(biāo)基因(PKD1和PKD2)尋找最優(yōu)的表達(dá)系統(tǒng)。“如通過基因編碼的優(yōu)化,可提高蛋白的表達(dá)量,從而拿到體外重組蛋白質(zhì)。”王廷亮說。
此時(shí),目標(biāo)蛋白仍舊在細(xì)胞中,下一步是將目標(biāo)蛋白從復(fù)雜的細(xì)胞中“釣”出來。大量的提取條件摸索,如嘗試和篩選了大量的去垢劑、確定蛋白邊界等,才能形成“不錯殺一個、不漏網(wǎng)一千”的數(shù)量和質(zhì)量上的平衡。最終,課題組獲得了珍貴稀少的目標(biāo)蛋白。“50升的細(xì)胞只能提取出100微克左右蛋白,只夠完成3—5次‘上鏡’制備,符合電鏡數(shù)據(jù)收集要求的樣品往往只有1到2個。”王廷亮說。
螞蟻搬家,“反推”出高精度三維結(jié)構(gòu)
冷凍電鏡通過發(fā)射電子、并測定電子通過蛋白質(zhì)分子后軌跡變化的方式,達(dá)到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)A級精度地呈現(xiàn)。其每次掃描的視域非常狹小。因此,蛋白“上鏡”后,需要長時(shí)間運(yùn)轉(zhuǎn)和巨量信息處理。對于超大結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)來說,研究者將收集到倍數(shù)增加的大量數(shù)據(jù),再通過計(jì)算進(jìn)行結(jié)構(gòu)的再現(xiàn)。
整個蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的成型猶如螞蟻搬家,在獲得大量多角度二維圖片后,由后期的三維重建系統(tǒng)對圖片數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和重構(gòu),并通過可視化系統(tǒng)形成蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的示意圖。
通過冷凍電鏡掃描,施一公團(tuán)隊(duì)獲得了多囊蛋白1和多囊蛋白2形成的獨(dú)特一比三復(fù)合物結(jié)構(gòu),并對該結(jié)構(gòu)和生化數(shù)據(jù)進(jìn)行了進(jìn)一步分析。
“面目”清晰,提出多囊腎發(fā)病機(jī)制新觀點(diǎn)
蛋白復(fù)合物的清晰面目為假說給出了“鐵證”或“反證”。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了與當(dāng)下主流學(xué)術(shù)觀點(diǎn)相悖的多個現(xiàn)象。論文第一作者宿強(qiáng)解釋,“多囊腎研究領(lǐng)域內(nèi)對這兩個蛋白是否形成鈣離子通道一直存有爭議,解析結(jié)構(gòu)不支持復(fù)合物為鈣離子通道的假說。”
該復(fù)合物結(jié)構(gòu)也刷新了結(jié)構(gòu)生物學(xué)家對電壓門控離子通道類似折疊“長相”的認(rèn)識。之前報(bào)道的大多數(shù)離子通道類似折疊結(jié)構(gòu)或者是同源四聚體,或者是單鏈的假四次對稱體,這個卻是兩個蛋白組成的一比三的復(fù)合物。
“有意思的是,其中一個蛋白自己單獨(dú)也能形成四聚體。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)意味著不同的工作機(jī)理和調(diào)控方式,豐富了結(jié)構(gòu)生物學(xué)家對電壓門控離子通道類似折疊蛋白組裝的理解。”宿強(qiáng)說。
15年前“出題”的論文中猜測多囊蛋白1和多囊蛋白2的“協(xié)作”模式有4種,隨著結(jié)構(gòu)的清晰,這些假設(shè)將很快有明確答案,給多囊腎病的機(jī)制研究帶來有益的參考。