作為一對“強大”的技術(shù)，XL-MS和cryo-EM在結(jié)合運用中在共同彌補著各自的缺點不足。當(dāng)cryo-EM圖像中分子區(qū)域定義不太清晰明確時，XL-MS就會介入，提供關(guān)于特定氨基酸殘基關(guān)鍵信息，從而可以識別蛋白質(zhì)并準(zhǔn)確推斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。以下，讓我們詳細探討一下這兩種技術(shù)的發(fā)展情況，以及它們?nèi)绾喂餐苿咏Y(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域進入一個新的時代。

　　蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)：“組裝機器的計劃藍圖”

　　蛋白質(zhì)及其復(fù)合物是生物細胞的生物“主力”，調(diào)節(jié)著細胞功能不可或缺的過程，如細胞生長、細胞死亡以及細胞生命周期的各個階段。

　　“我喜歡將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與組裝機器的藍圖進行比較，”荷蘭格羅寧根大學(xué)高分辨率cryo-EM實驗室助理教授Cristina Paulino在最近的一次采訪中談到，“雖然遺傳學(xué)和生物化學(xué)有助于理解蛋白質(zhì)的生理作用，但結(jié)構(gòu)生物學(xué)揭示了這些納米機器的外觀以及它們的連接方式。”

　　因此，對這種“連接方式”的了解為科學(xué)家們提供了修復(fù)、設(shè)計和復(fù)制蛋白質(zhì)，或潛在地阻斷蛋白質(zhì)功能的機會——蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，預(yù)計將成為個性化醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代藥理學(xué)不可或缺的組成部分。

　　關(guān)于XL-MS技術(shù)應(yīng)用

　　生物學(xué)的一個基本原理是蛋白質(zhì)由氨基酸殘基通過肽鍵連接形成多肽。除了肽鍵外，還存在非共價鍵，如范德華力、靜電和疏水相互作用。在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中，這些鍵很難檢測到，在原子水平上研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)時增加了額外的復(fù)雜性。在過去的十年中，蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域見證了MS技術(shù)逐漸增加豐富的一系列令人深刻的技術(shù)，其中。XL-MS技術(shù)是已證明對結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)不可或缺的技術(shù)之一。[1]

　　圖1總結(jié)了典型XL-MS的工作流程，其中，蛋白質(zhì)(或其鄰近)之間的非共價鍵相互作用(或接近它們)通過用交聯(lián)試劑溶解天然蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為人工共價鍵。由于賴氨酸殘基的廣泛存在、在水溶液中的穩(wěn)定性和高反應(yīng)活性，賴氨酸殘基的伯胺基團或蛋白質(zhì)的N-末端是交聯(lián)劑的常見靶標(biāo)。最常用的是同位功能交聯(lián)劑包括辛二酸二琥珀酰胺(DSS)和辛二酸(磺基琥珀酰亞胺基)。[2]在交聯(lián)階段之后，蛋白質(zhì)被蛋白酶加工成肽段。

圖1：通用XL-MS工作流程。圖片來源：烏得勒支大學(xué)Heck實驗室Richard Scheltema

　　“隨后通過MS測量混合物進行鑒定——在大多數(shù)情況下，可以指定交聯(lián)中涉及的氨基酸，用間隔臂的長度和兩側(cè)鏈的長度定義的距離進行約束” 烏特勒支大學(xué)Heck實驗室Richard Scheltema博士解釋說，“這些距離限制提供了關(guān)于蛋白質(zhì)如何折疊(兩種來自相同蛋白質(zhì)的肽段)或蛋白質(zhì)相互作用的有價值的信息，以及這種相互作用的界面位于何處(兩種來自不同的蛋白質(zhì)肽段)。”

　　通常情況下，XL-MS實現(xiàn)的結(jié)構(gòu)分辨率在15-50埃米，其分辨率無法與X射線晶體學(xué)、核磁共振(NMR)光譜學(xué)、cryo-EM等其他結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)的分辨率相匹敵。因此，這些技術(shù)必須相互補充使用。[3]

　　cryo-EM：提供的進一步解決方案

　　冷凍電鏡(cryo-EM)是由透射電鏡(TEM)發(fā)展而來的，它通過二維(2D)圖像投影來確定三維(3D)結(jié)構(gòu)，同時保持樣品的完整性和結(jié)構(gòu)接近原始狀態(tài)。這是通過研究玻璃化狀態(tài)下的樣品來實現(xiàn)的。在玻璃化狀態(tài)下，樣品的薄片迅速浸入液態(tài)乙烷溶液中，低溫保存并保護其免受TEM內(nèi)的真空和輻射損傷。[4]Paulino也進一步討論了cryo-EM與其他結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)相比的優(yōu)勢。

　　近年來，cryo-EM技術(shù)已經(jīng)取得了長足的進步，這意味著許多樣品現(xiàn)在可以用近原子分辨率(通常為3-5埃)進行分析。[5]不幸的是，在這個分辨率范圍內(nèi)，科學(xué)家們?nèi)匀浑y以區(qū)分和表征蛋白質(zhì)復(fù)合物中所有氨基酸側(cè)鏈，這意味著重新構(gòu)建模型是一項復(fù)雜的任務(wù)。“cryo-EM的使用正在大幅增加，從這項技術(shù)記錄的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)輪廓來看，很難確定哪些蛋白質(zhì)相互關(guān)聯(lián)，以及它們在整個結(jié)構(gòu)中是如何排列的。而這就是XL-MS介入的地方。

　　XL-MS中的交聯(lián)數(shù)據(jù)描述了肽段中兩個特定氨基酸殘基之間的最大距離。將提出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型及其結(jié)構(gòu)域插入由cryo-EM重構(gòu)獲得的三維體中，并整合交聯(lián)數(shù)據(jù)，以驗證蛋白質(zhì)復(fù)合物內(nèi)特定肽的位置和方向。

　　將蛋白質(zhì)整合到三維體中是一項艱巨而復(fù)雜的任務(wù)，需要對所涉及的蛋白質(zhì)復(fù)合物及其子成分有透徹的理解。因此，Sali團隊開發(fā)了集成建模平臺(IMP)，這是一個希望將XL-MS和cryo-EM結(jié)合起來的研究人員的通用工作流程平臺。

　　XL-MS和cryo-EM在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中被配合應(yīng)用

　　最近，Henry等人確定了載脂蛋白E4(ApoE4)的活性結(jié)構(gòu)和結(jié)合機制。ApoE4與阿爾茨海默病(AD)和心血管疾病(CVD)有關(guān)，是載脂蛋白(ApoE)的脂質(zhì)化同種型，ApoE是一種蛋白質(zhì)，通過充當(dāng)細胞表面受體的配體，促進富含膽固醇的脂蛋白的內(nèi)化。采用結(jié)合XL-MS，cryo-EM和生物信息學(xué)建模工具的混合方法，Henry等表明ApoE4存在于兩種不同的確證中，指向依賴于調(diào)節(jié)其受體結(jié)合區(qū)可及性的激活機制。作者指出，這些發(fā)現(xiàn)可能對于解釋蛋白質(zhì)在AD和CVD中的作用以及隨后潛在治療方法的發(fā)展具有重要價值。[6]

　　Schmidt和Urlaub在2017年全面綜述中概述了類似的令人印象深刻的研究，包括Lührmann和Stark組對剪接體的結(jié)構(gòu)表征。

　　2019年1月，荷蘭科學(xué)研究組織(NWO)向一個名為“細胞中蛋白質(zhì)社會行為的監(jiān)測和可視化”的項目撥款160萬歐元的資助，其中XL-MS和cryo-EM技術(shù)以及其他分子方法，被綜合使用。項目可視化了蛋白質(zhì)之間的相互作用，該項目的主要研究人員包括Albert Heck、John van der Oost、Alexandre Bonvin、Friedrich Foerster和Scheltema等人。

　　“在這個項目中，我們的目標(biāo)是使用(一種cryo-EM的專門應(yīng)用)，在選定的一組嗜熱菌中不偏倚地發(fā)現(xiàn)所有的蛋白質(zhì)復(fù)合物。在這里，XL-MS被用來提供識別復(fù)合物內(nèi)蛋白質(zhì)的身份、空間順序(通常不能直接從斷層掃描數(shù)據(jù)中得到答案)，以及結(jié)構(gòu)模型來填補最終的空白。” Scheltema說，“之所以選擇嗜熱菌，是因為這些微生物是具有生物化學(xué)用途的蛋白質(zhì)復(fù)合物的潛在寶庫。”

　　重新定義限制，繼續(xù)前進

　　總之，XL-MS和cryo-EM為結(jié)構(gòu)蛋白組學(xué)領(lǐng)域提供了巨大的發(fā)展?jié)摿?。然而，每種技術(shù)都面臨著自己的局限性，必須克服這些局限性才能形成完美的配合使用。

　　“Cryo-EM不斷重新定義其局限性，但我們?nèi)匀幻媾R著一些挑戰(zhàn)，”Paulino評論道，“對于X射線晶體學(xué)來說，獲得完全可操作和維護的同步加速器束流線基本上是免費的，而cryo-EM的高成本和操作顯微鏡所需要的專業(yè)知識水平便成為一個障礙。” 在一定程度上(但并非全部)，政府實施對Cryo-EM設(shè)備的補貼政策的解決了這一問題。

　　“冷凍斷層掃描提供了一種相對較低分辨率的蛋白質(zhì)復(fù)合物視圖，直接解釋很困難。” Scheltema補充說，“另一方面，來自XL-MS的數(shù)據(jù)提供了解決方案中包含所有空間信息的視圖。然而，我認(rèn)為將這兩者聯(lián)系起來是最大的挑戰(zhàn)，因為XL-MS提供了樣本中所有蛋白質(zhì)的信息， 這需要以某種方式過濾掉由斷層掃描揭示的復(fù)合物內(nèi)的蛋白質(zhì)。”