2019年7月5日,原清華大學(xué)顏寧(清華大學(xué)第一單位)等人Nature 在線發(fā)表題為“Modulation of cardiac ryanodine receptor 2 by calmodulin”的研究論文,該研究報(bào)道了RyR2的8個(gè)冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)結(jié)構(gòu),它們共同揭示了不同形式CaM的分子識(shí)別特征,并提供了對(duì)CaM對(duì)RyR2通道門控的調(diào)節(jié)的見(jiàn)解。Apo-CaM和Ca2 + -CaM結(jié)合由手柄,螺旋和中心區(qū)域形成的細(xì)長(zhǎng)裂縫中的不同但重疊的位點(diǎn)。RyR2上CaM結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)變受Ca2 +與CaM結(jié)合而不是RyR2的控制。Ca2 + -CaM誘導(dǎo)各個(gè)中心結(jié)構(gòu)域的旋轉(zhuǎn)和域內(nèi)移位,導(dǎo)致PCB95和Ca2 +激活的通道的孔閉合。相比之下,ATP,咖啡因和Ca2 +激活通道的孔在Ca2 + -CaM存在下保持開(kāi)放,這表明Ca2 + -CaM是RyR2門控的許多競(jìng)爭(zhēng)調(diào)節(jié)劑之一。
L型電壓門控Ca2 +(Cav)通道由各種化合物調(diào)節(jié),例如1,4-二氫吡啶(DHP),苯并硫氮雜卓(BTZ)和苯基烷基胺(PAA),其中許多已被用于表征通道性質(zhì)和用于治療高血壓和其他疾病。2019年5月30日,顏寧(清華大學(xué)為第一通訊單位)及吳建平共同通訊在Cell 在線發(fā)表題為“Molecular Basis for Ligand Modulation of a Mammalian Voltage-Gated Ca2+ Channel”的研究論文,該研究報(bào)告了Cav1.1與拮抗藥物硝苯地平,地爾硫卓和維拉帕米的復(fù)合物的冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)結(jié)構(gòu),分辨率分別為2.9Å,3.0Å和2.7Å;Cav1.1與DHP激動(dòng)劑Bay K 8644復(fù)合物的冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)結(jié)構(gòu),分辨率為2.8Å。地爾硫卓和維拉帕米穿過(guò)孔域的中心腔,直接阻斷離子滲透。盡管硝苯地平和Bay K 8644在重復(fù)III和IV的界面處占據(jù)相同的位點(diǎn),但協(xié)調(diào)細(xì)節(jié)支持以前的功能觀察。這些結(jié)構(gòu)闡明了不同Cav配體的作用模式,并為結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的藥物發(fā)現(xiàn)建立了框架??傊?strong style="box-sizing: border-box; margin: 0px; -webkit-appearance: none;">結(jié)構(gòu)研究闡明了三種臨床應(yīng)用的拮抗劑和原型激動(dòng)劑在原子水平上識(shí)別和調(diào)節(jié)L型Cav通道的分子基礎(chǔ),并為大量實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)提供結(jié)構(gòu)解釋。這些結(jié)構(gòu)為未來(lái)針對(duì)Cav通道病的藥物發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。2019年5月24日,顏寧及龔欣共同通訊在Nature Communications在線發(fā)表題為“Inhibition of tetrameric Patched1 by Sonic Hedgehog through an asymmetric paradigm”的研究論文,該研究報(bào)告四聚體Ptch1與Sonic hedgehog(ShhNp)的棕櫚?;疦-末端信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的冷凍-EM結(jié)構(gòu),以4:2的化學(xué)計(jì)量比復(fù)合。該結(jié)構(gòu)顯示四個(gè)Ptch1被組織為二聚體的疏松二聚體,每個(gè)二聚體通過(guò)兩個(gè)不同的抑制界面與一個(gè)ShhNp結(jié)合,一個(gè)主要通過(guò)ShhNp的N-末端肽和棕櫚?;糠?,另一個(gè)通過(guò)ShhNp上的Ca2 +介導(dǎo)的界面。該結(jié)構(gòu)闡明了Ptch1的四聚體組裝,并提出了Hh配體的不對(duì)稱作用模式,用于抑制Ptch1的潛在膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)活性??傊?,與棕櫚?;疭hhN以4:2化學(xué)計(jì)量比復(fù)合的四聚體Ptch1的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步完成了Ptch1和Shh之間相互作用的分子圖譜,為將來(lái)研究Hh信號(hào)傳導(dǎo)設(shè)定了重要的框架。
心肌收縮是由Ca2 +進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)引起的,最初來(lái)自細(xì)胞外環(huán)境,由Cav1.2介導(dǎo),隨后由肌漿網(wǎng)Ca2 +儲(chǔ)存,由RyR2介導(dǎo)。 Ryanodine受體是已知最大的離子通道,由分子量大于2兆道爾頓的同源四聚體組成。超過(guò)80%的蛋白質(zhì)折疊成多結(jié)構(gòu)域,感知與各種調(diào)節(jié)劑的相互作用,從離子到蛋白質(zhì)。 RyR2活性的精確調(diào)節(jié)對(duì)于每次心跳都是至關(guān)重要的, RyR2的異?;顒?dòng)與危及生命的心律失常相關(guān)。
RyR2-CaM復(fù)合物的Cryo-EM結(jié)構(gòu)
17kDa的CaM蛋白是一種重要的鈣傳感器,在大多數(shù)鈣信號(hào)傳導(dǎo)事件中起著重要作用。 CaM由大致對(duì)稱的N-和C-末端葉組成,通過(guò)柔性鉸鏈連接。每個(gè)葉可以通過(guò)兩個(gè)EF-手(螺旋E和F-手)基序與兩個(gè)Ca2 +離子配合,具有微摩爾范圍的結(jié)合親和力。在Ca2 +結(jié)合后,兩個(gè)葉中的幾個(gè)疏水殘基的暴露促進(jìn)CaM與靶序列的結(jié)合。 CaM與ryanodine受體直接相互作用,CaM-RyR的化學(xué)計(jì)量比為1:1,在納摩爾范圍的結(jié)合親和力。
CaM和RyR2之間的接口
然而,CaM對(duì)ryanodine受體的調(diào)節(jié)是同種型特異性的。 CaM顯示RyR1的雙相調(diào)節(jié),作為納摩爾水平的Ca2 +(apo-CaM)的弱激活劑和微摩爾水平的Ca2 +(Ca2 + -CaM)的抑制劑。相反,apo-CaM對(duì)RyR2沒(méi)有作用或抑制作用,而Ca2 + -CaM抑制RyR2。 CaM還被證明有助于終止存儲(chǔ)過(guò)載誘導(dǎo)的Ca2 +釋放(SOICR)。 CaM和RyR2之間的異常相互作用與心力衰竭相關(guān),CaM-RyR2相互作用受損的糾正可以作為壓力超負(fù)荷引起的心力衰竭致死性心律失常的治療。
Ca2 +負(fù)載后CaM結(jié)合位點(diǎn)移位的分子基礎(chǔ)
RyR-CaM復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表征局限于低分辨率電子顯微鏡圖,其表明在RyR1中對(duì)于apo-和Ca2 + -CaM存在兩個(gè)重疊但不同的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)應(yīng)于RyR1的殘基3614-3643(RyR2的中心結(jié)構(gòu)域中的殘基3581-3612)的肽結(jié)合apo-CaM和Ca2 + -CaM。與肽結(jié)合的Ca2 + -CaM的晶體結(jié)構(gòu)揭示了肽的N和C末端的疏水錨,其分別容納Ca2 + -CaM的C-和N-葉。
通過(guò)CaM調(diào)制RyR2的示意圖
為了闡明CaM對(duì)RyR2的調(diào)節(jié),該研究報(bào)道了RyR2的8個(gè)冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)結(jié)構(gòu),它們共同揭示了不同形式CaM的分子識(shí)別特征,并提供了對(duì)CaM對(duì)RyR2通道門控的調(diào)節(jié)的見(jiàn)解。Apo-CaM和Ca2 + -CaM結(jié)合由手柄,螺旋和中心區(qū)域形成的細(xì)長(zhǎng)裂縫中的不同但重疊的位點(diǎn)。RyR2上CaM結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)變受Ca2 +與CaM結(jié)合而不是RyR2的控制。Ca2 + -CaM誘導(dǎo)各個(gè)中心結(jié)構(gòu)域的旋轉(zhuǎn)和域內(nèi)移位,導(dǎo)致PCB95和Ca2 +激活的通道的孔閉合。 相比之下,ATP,咖啡因和Ca2 +激活通道的孔在Ca2 + -CaM存在下保持開(kāi)放,這表明Ca2 + -CaM是RyR2門控的許多競(jìng)爭(zhēng)調(diào)節(jié)劑之一。