賽默飛推出Q Orbitrap旗艦機Orbitrap Exploris™ 480已經(jīng)有一段時間了，集結了LFQ, TMT10plex, TMT11plex, TMT16plex及TurboTMT, vDIA, HR-DIA, BoxCarDDA, BoxCarDIA, PRM及SureQuant等一系列定量功能，相信大家對其整體的定量性能充滿好奇。
本期我們將要帶大家走入Exploris 480的定量之路。
1.Orbitrap Exploris™ 480質譜儀——精zhun的非標記定量
FAIMS Pro可以通過多肽帶電性質的不同分離肽段，從而作為一種在線的氣態(tài)樣品分級手段來提高復雜樣品的定性和定量效率。Exploris 480搭載FAIMS Pro，數(shù)據(jù)分析采用Proteome Discoverer2.4，將FDR設置為1%，60min和120min可分別從1ug Hela全細胞酶解產(chǎn)物中鑒定近6300個和7300個蛋白（圖1）。
圖1. Orbitrap Exploris™ 480 搭載FAIMS Pro的鑒定結果
用全細胞酶解產(chǎn)物評估非標記定量的重現(xiàn)性亦得到很好的結果，三次重復的重現(xiàn)性高達97%，蛋白定量CV值低至5%（圖2）。
圖2. Orbitrap Exploris™ 480非標記定量的重現(xiàn)性評估
2.FAIMS Pro 接口——TurboTMT助力多重蛋白質組學研究
10標以及11標的TMT定量憑借其“高產(chǎn)”的優(yōu)勢，一直備受歡迎。對于高于10標的TMT定量而言，相鄰報告離子基團僅存在6mDa的質量差異，至少需要采用35,000的分辨率進行準確分辨，只能在Orbitrap平臺上實現(xiàn)；另外，共流出肽段的干擾也會影響TMT-MS2定量準確性。因此，10標以及11標的TMT定量也一直受到掃描速度和共流出肽段干擾兩個問題的困擾。針對這兩個問題，Exploris 480上給出了完整的解決方案（圖3）。
圖3. Orbitrap Exploris™ 480的TMT定量的性能評估
Exploris 480的TurboTMT采用ΦSDM譜圖后處理算法，當使用15,000分辨率采集數(shù)據(jù)時，報告離子處的分辨率達到了50,000，從而在保證區(qū)分質量虧損級差異的報告離子前提下提升掃描速度；Exploris 480搭載FAIMS Pro，基于價態(tài)在線分級可以緩解共流出肽段干擾的問題，從而提高定量準確度。TMT11標酵母標準品的結果也證明，Exploris 480結合Turbo-TMT和FAIMS Pro可顯著提升了樣品的定量深度和準確性（圖4）。
圖4. Turbo-TMT和FAIMS Pro顯著提升定量深度和準確性）
3.DIA分析方案
隨著蛋白質組學的進一步發(fā)展，尤其對于精zhun醫(yī)學、臨床大隊列轉化醫(yī)學等研究，DIA分析策略也備受青睞。結合Orbitrap超高分辨質譜在蛋白質組學領域的技術優(yōu)勢，賽默飛在2018年ASMS上提出了基于微流液相和Orbitrap超高分辨質譜的數(shù)據(jù)非依賴采集工作流(HRMS1-DIA)，采用超高分辨一級掃描定量策略(R>120,000)。
我們使用已知組成的人、酵母、大腸桿菌混合樣品，在11個實驗室對HRMS1-DIA工作流進行定量準確性和穩(wěn)定性的長期多中心驗證（圖5）。各實驗室平均可以鑒定到超過8000個蛋白，定量超過6000個蛋白，且定量準確度高于0.9。
圖5. HRMS1-DIA的長期多中心驗證。
A. 蛋白鑒定和定量數(shù)量;
B. 實驗室間的蛋白定量散點圖;
C.日間鑒定及定量蛋白的重現(xiàn)性
4.BoxCar分析流程
2018年Matthias實驗室在Nature Methods上發(fā)表了全新的BoxCar采集方式，一級全掃采用分段累積合并掃描的方式，降低高豐度肽段對低豐度肽段的信號壓制，提升一級掃描的動態(tài)范圍，從而增加血漿等動態(tài)范圍大的樣本解析深度（圖6）。
圖6. BoxCar工作流程示意圖
Exploris 480為客戶提供更為便捷的BoxCar DDA 和BoxCar DIA 定量新方案（圖7），極大的豐富了現(xiàn)有的定量流程。
圖7. Orbitrap Exploris™ 480質譜的BoxCar操作界面
5.靶向定量的新思路b
就如眾多研究對高通量信息挖掘的需求一樣，差異蛋白的高可信量化也至關重要。傳統(tǒng)檢測方法多基于免疫反應，常常會受到抗體的可獲得性、特異性和穩(wěn)定性的困擾。平行反應監(jiān)測（Parallel Reaction Monitoring,PRM）是Orbitrap超高分辨系列儀器上獨有的靶向定量方法，采用高分辨掃描，可有效排除復雜基質干擾。相比于傳統(tǒng)的SRM和MRM，PRM采用高分辨二級全掃，無需優(yōu)化碰撞能量，無需指定子離子，方法開發(fā)更加簡單，是目前已被廣泛運用的金標驗證方法。
與此同時，經(jīng)常也會被問到的一個問題：一針采集中PRM能監(jiān)測多少條肽段？基于2015年Gallien等人在MCP上發(fā)表的IS-PRM思路，Exploris 480上提供了更強健、更便捷的SureQuant定量新方法(圖8)。
圖8. SureQuant定量新方法
SureQuant IS 靶標分析250ng含有50fmol 內標的細胞酶解物，如圖9所示，相比于PRM20%的生產(chǎn)力，SureQuant方法將生產(chǎn)力提高至80%；此外，SureQuant不依賴于預設保留時間，能夠實現(xiàn)可靠穩(wěn)定的靶標定量。
圖9. SureQuant改善生產(chǎn)力(圖9a)和保留時間漂移(圖9b)的限制
我們以AKT/mTOR通路分析作為一個例子，基于Capillary流速LC-MS平臺，以Hela全蛋白酶解產(chǎn)物為樣品，對AKT/mTOR通路中的12個蛋白/30條肽段進行PRM和SureQuant靶向定量分析。實驗結果表明，SureQuant的肽段檢出效率明顯高于PRM（圖10）。
圖10. SureQuant靶向監(jiān)測酶解產(chǎn)物中AKT/mTOR 通路的內源肽段
定量蛋白質組學完整解決方案
Orbitrap Exploris™ 480質譜儀作為全新一代Q Orbitrap系列旗艦機，具備ji佳的性能和重現(xiàn)性。擁有LFQ，TMT及TurboTMT，DIA、HR-DIA、BoxCar、PRM及SureQuant等多樣化的定量解決方案，在同一臺儀器上完成從大規(guī)模發(fā)現(xiàn)到靶向驗證所有工作，是蛋白質組學、精zhun醫(yī)學、生物制藥等研究的不二選擇。
