小代君說(shuō)
PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡(jiǎn)稱。又稱為特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，這種方法可以把極微量的靶DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬(wàn)倍，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新。
PCR技術(shù)憑借特異性強(qiáng)、靈敏度高、對(duì)檢測(cè)樣品要求低、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各種臨床診斷。目前國(guó)內(nèi)二級(jí)以上的醫(yī)院都在開(kāi)展PCR技術(shù)的各種臨床應(yīng)用，PCR實(shí)驗(yàn)室是承載PCR技術(shù)應(yīng)用的設(shè)施，實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)計(jì)才能確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性，因此，PCR實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)和建設(shè)越來(lái)越受到建設(shè)單位的重視。
從PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局、通風(fēng)空調(diào)系統(tǒng)兩個(gè)方面進(jìn)行設(shè)計(jì)要點(diǎn)分析，供設(shè)計(jì)同行和建設(shè)單位的相關(guān)人員參考。
PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局設(shè)計(jì)要點(diǎn)分析
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1、平面功能分區(qū)要點(diǎn)分析
根據(jù)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》1.1條的要求，PCR實(shí)驗(yàn)室一般由試劑儲(chǔ)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)4個(gè)區(qū)域組成。
PCR實(shí)驗(yàn)室區(qū)域的設(shè)置并不是一成不變的，以下幾種情況需要說(shuō)明：
①如果樣本在擴(kuò)增之前需要粉碎處理，則需要增加一個(gè)區(qū)域用于樣品的粉碎;
②如果采用實(shí)時(shí)熒光PCR法，則擴(kuò)增區(qū)和分析區(qū)可以合并為一個(gè)區(qū);
③如果采用全自動(dòng)化PCR分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和分析區(qū)可以合并為一個(gè)區(qū)。
以4個(gè)區(qū)域的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置進(jìn)行設(shè)計(jì)要點(diǎn)分析，如圖1所示。
▲圖1 典型PCR 實(shí)驗(yàn)室工藝平面圖
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2、實(shí)驗(yàn)室功能與設(shè)備設(shè)計(jì)要點(diǎn)分析
(1)試劑儲(chǔ)備區(qū)
該區(qū)域主要完成試劑和主反應(yīng)混合液的儲(chǔ)存、配制和封裝工作。所有運(yùn)送到該區(qū)域的試劑和材料不應(yīng)經(jīng)過(guò)其他區(qū)域，試劑和原材料應(yīng)在本區(qū)內(nèi)儲(chǔ)存和制備。本區(qū)域的氣壓應(yīng)相對(duì)外界保持正壓。該區(qū)域的設(shè)備主要是冰箱、天平、混勻器、低速離心機(jī)、加樣器、可移動(dòng)紫外燈等。由于該區(qū)域有多種試劑，所以“安全”應(yīng)是平面設(shè)計(jì)首要考慮因素，平面設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)保持通風(fēng)流暢、逃生暢通。首先，實(shí)驗(yàn)臺(tái)布置在房間的兩側(cè)，中間的過(guò)道全部通向走廊便于疏散。同時(shí)根據(jù)國(guó)際人體工程學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)臺(tái)與實(shí)驗(yàn)臺(tái)通道設(shè)計(jì)為1500mm，中間的通道可滿足兩邊坐人中間過(guò)人的要求。
(2)標(biāo)本制備區(qū)
該區(qū)域的功能是樣本的保存、核酸提取和貯存、樣本加入擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定DNA的合成。樣本應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)并儲(chǔ)存在本區(qū)內(nèi)，不得經(jīng)過(guò)其他區(qū)域。對(duì)于氣流壓力的控制，由于在本區(qū)內(nèi)加樣操作可能產(chǎn)生氣溶膠，為避免氣溶膠擴(kuò)散出去對(duì)外界造成污染，本區(qū)應(yīng)對(duì)外界保持負(fù)壓;同時(shí)本區(qū)相對(duì)于擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)以及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)為正壓，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。
該區(qū)域的設(shè)備主要是生物安全柜、加樣器、臺(tái)式高速離心機(jī)、臺(tái)式低速離心機(jī)、水浴鍋、冰箱、混勻器和可移動(dòng)紫外燈等。其中需要注意的是，生物安全柜最好選用B2型，這種生物安全柜所有的吸入氣流和垂直氣流都經(jīng)過(guò)高效過(guò)濾器過(guò)濾后排到室外，不再進(jìn)入生物安全柜循環(huán)或者返回該區(qū)域，這種生物安全柜可避免提取核酸在柜內(nèi)反復(fù)循環(huán)，造成標(biāo)本之間交叉“污染”，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
(3)擴(kuò)增區(qū)
該區(qū)域的功能是DNA擴(kuò)增和擴(kuò)增片段的測(cè)定。此外，反應(yīng)混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液和已制備的DNA模板(來(lái)自標(biāo)本制備區(qū))的加入等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。對(duì)于氣流壓力的控制，相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。
該區(qū)域的設(shè)備主要是核酸擴(kuò)增熱循環(huán)儀、加樣器、超凈臺(tái)等。其中熱循環(huán)儀的電源應(yīng)專用，并配備一個(gè)穩(wěn)壓電源或UPS，以防止由于電壓的波動(dòng)對(duì)擴(kuò)增測(cè)定的影響。
(4)分析區(qū)
該區(qū)域的功能是擴(kuò)增產(chǎn)物的分析。該區(qū)域可能會(huì)用到某些可致基因突變的有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。對(duì)于氣流壓力的控制，該區(qū)域是PCR實(shí)驗(yàn)的最后一步，壓力應(yīng)為最低，相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。
該區(qū)域的設(shè)備主要是加樣器、電泳儀(槽)、電轉(zhuǎn)印儀、雜交爐或雜交箱、水浴箱、DNA測(cè)序儀、酶標(biāo)儀和洗板機(jī)等。
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3、人流與物料流線設(shè)計(jì)要點(diǎn)分析
進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室區(qū)域工作人員應(yīng)該按照以下路徑：
走道→緩沖間→實(shí)驗(yàn)區(qū)
工作人員退出實(shí)驗(yàn)室的路徑為：
實(shí)驗(yàn)區(qū)→緩沖間→走道
進(jìn)入各個(gè)區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，不同的工作區(qū)域使用不同的工作服(例如不同的顏色)。工作人員離開(kāi)時(shí)，不得將工作服帶出。這種人員的單向流動(dòng)可以降低因人員的流動(dòng)帶來(lái)的交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。
所有的物品進(jìn)入實(shí)驗(yàn)區(qū)必須經(jīng)過(guò)雙扉互鎖傳遞窗，利用傳遞窗消毒后才可進(jìn)入，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有物品也必須經(jīng)過(guò)傳遞窗才可以傳遞到實(shí)驗(yàn)室以外的清潔公共區(qū)。這種物品有組織的單向流動(dòng)可以降低物品的差錯(cuò)和混淆的風(fēng)險(xiǎn)。
PCR實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)空調(diào)系統(tǒng)設(shè)計(jì)要點(diǎn)分析
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1、溫濕度需求分析
不同于血液制品、疫苗等有低溫低濕潔凈區(qū)域的需求(如2~8℃，≤35%，C級(jí)/D級(jí))，PCR實(shí)驗(yàn)室一般來(lái)說(shuō)對(duì)溫濕度沒(méi)有嚴(yán)格要求，考慮實(shí)驗(yàn)人員的人體舒適性，環(huán)境溫濕度的設(shè)計(jì)參數(shù)控制在表1所示的范圍內(nèi)。
表1 空氣調(diào)節(jié)環(huán)境溫濕度設(shè)計(jì)參數(shù) |
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參數(shù) |
冬季 |
夏季 |
溫度/℃ |
18 ~ 24 |
25~ 28 |
濕度/% |
- |
40 ~ 70 |
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2、空氣過(guò)濾及氣流組織分析
由于PCR實(shí)驗(yàn)室在加樣操作過(guò)程中可能產(chǎn)生氣溶膠，為避免氣溶膠擴(kuò)散出去對(duì)外界造成污染，同時(shí)為了避免各房間之間通過(guò)風(fēng)管系統(tǒng)交叉污染，實(shí)驗(yàn)室建議采用全新風(fēng)系統(tǒng)。新風(fēng)經(jīng)熱濕處理及三級(jí)(初效+中效+高效/亞高效)過(guò)濾后送入室內(nèi);各房間排風(fēng)口單獨(dú)設(shè)置高效或亞高效過(guò)濾器。
風(fēng)量計(jì)算上，通常我們采用縫隙法來(lái)計(jì)算房間維持一定壓差時(shí)所需要的排風(fēng)量或送風(fēng)量?？p隙法計(jì)算公式如下：
式中 ΔP——壓差，Pa ；
ρ ——空氣密度，取1.2 kg/m³；
V ——風(fēng)量，m³/h ；
A ——根據(jù)縫隙寬度計(jì)算的泄漏面積，m² ；
μ ——常數(shù)，取0.72。
由風(fēng)量守恒可知：
V送風(fēng) -ΔV = V排風(fēng)
式中 ΔV —— 壓差滲透風(fēng)量，
當(dāng)房間維持正壓時(shí)，該值為正值，
當(dāng)房間維持負(fù)壓時(shí)，該值為負(fù)值。
當(dāng)房間無(wú)工藝設(shè)備排風(fēng)時(shí)，可通過(guò)換氣次數(shù)(工藝操作間換氣次數(shù)為12~15次/h，緩沖間6~8次/h)計(jì)算得出房間送風(fēng)量，然后根據(jù)縫隙法得出房間排風(fēng)量;當(dāng)房間有工藝設(shè)備(如生物安全柜)排風(fēng)時(shí)，比較設(shè)備排風(fēng)量與滿足換氣次數(shù)所需送風(fēng)量，取兩者之間的較大值(一般情況下，設(shè)備排風(fēng)量較大)，然后可根據(jù)縫隙法得出房間送風(fēng)量。根據(jù)以上計(jì)算風(fēng)量為設(shè)計(jì)依據(jù)，由此可對(duì)新風(fēng)機(jī)組、排風(fēng)機(jī)組及附屬的風(fēng)管風(fēng)口進(jìn)行選型和計(jì)算。
氣流組織上，PCR實(shí)驗(yàn)室空調(diào)系統(tǒng)通常采用上送下排式的非單向流送風(fēng)方式。房間上部送風(fēng)口盡量均勻布置，且與生物安全柜操作面或其他有氣溶膠操作地點(diǎn)的正上方保持一定距離;房間下部利用室內(nèi)排風(fēng)夾道上設(shè)置的排風(fēng)口排風(fēng)，排風(fēng)口底部距地面0.1m，排風(fēng)夾道需設(shè)置于室內(nèi)被污染風(fēng)險(xiǎn)最高的區(qū)域，排風(fēng)口前面不應(yīng)有障礙物遮擋。
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3、壓力需求及控制分析
根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程，PCR實(shí)驗(yàn)室一般設(shè)有試劑儲(chǔ)存和試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)等4個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域均設(shè)置有獨(dú)立的緩沖間。
根據(jù)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》，為滿足潔污分流和防止交叉感染等要求，PCR實(shí)驗(yàn)室空氣流向需遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑儲(chǔ)存和試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)進(jìn)行，PCR實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)空調(diào)設(shè)計(jì)要點(diǎn)即在于此：通過(guò)對(duì)房間的送回(排)風(fēng)量進(jìn)行控制，使房間按照工藝設(shè)計(jì)要求建立相應(yīng)的壓力梯度，從而防止污染物的進(jìn)入或擴(kuò)散。
另外，PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通常有生物安全柜、通風(fēng)柜等生產(chǎn)設(shè)備，這類設(shè)備排風(fēng)量大且使用時(shí)間有間隔性，并不與空調(diào)系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)間一致，這就導(dǎo)致有這些設(shè)備的房間在設(shè)備啟停的時(shí)候很容易失壓，原本正常的壓力梯度瞬間就破壞了。這正是PCR實(shí)驗(yàn)室空調(diào)系統(tǒng)設(shè)計(jì)的難點(diǎn)所在。
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4、典型空調(diào)原理圖分析
基于文中PCR實(shí)驗(yàn)室的工藝布局，設(shè)計(jì)出該類實(shí)驗(yàn)室的典型原理圖，如圖2所示。
▲圖2 典型PCR實(shí)驗(yàn)室全空氣新風(fēng)系統(tǒng)控制原理圖
PCR實(shí)驗(yàn)室全空氣新風(fēng)系統(tǒng)控制說(shuō)明：
(1)溫濕度控制
夏季：調(diào)節(jié)表冷盤管動(dòng)態(tài)壓差平衡調(diào)節(jié)閥的開(kāi)度以控制室內(nèi)溫濕度，濕度優(yōu)先;當(dāng)為了調(diào)節(jié)室內(nèi)濕度而造成溫度過(guò)低時(shí)，開(kāi)啟加熱盤管以控制室內(nèi)溫度。
冬季：調(diào)節(jié)加熱盤管動(dòng)態(tài)壓差平衡電動(dòng)調(diào)節(jié)閥的開(kāi)度以控制室內(nèi)溫度，調(diào)節(jié)加濕器的開(kāi)度以控制濕度。
(2)壓力及變頻控制
在空調(diào)系統(tǒng)各房間送風(fēng)支管上設(shè)置壓力無(wú)關(guān)型定風(fēng)量閥，無(wú)工藝設(shè)備排風(fēng)房間的排風(fēng)支管上設(shè)置壓力無(wú)關(guān)型定風(fēng)量閥，從而恒定房間的風(fēng)量以控制房間壓力;在有工藝設(shè)備排風(fēng)房間的排風(fēng)支管上設(shè)變風(fēng)量閥，根據(jù)房間內(nèi)壓差動(dòng)作，以控制房間壓力。需排風(fēng)的工藝設(shè)備(如生物安全柜)排風(fēng)支管上設(shè)變風(fēng)量閥，根據(jù)設(shè)備開(kāi)啟度調(diào)節(jié)設(shè)備排風(fēng)量。
根據(jù)重要房間送風(fēng)管上定風(fēng)量閥前后壓差調(diào)節(jié)送風(fēng)機(jī)變頻器，保持壓差恒定值。此恒定值須由現(xiàn)場(chǎng)實(shí)調(diào)確認(rèn)，以保證所有定風(fēng)量閥正常工作為準(zhǔn)。
由以上原理圖可知，PCR實(shí)驗(yàn)室壓差控制難點(diǎn)在于有生物安全柜房間的壓差控制以及維持生物安全柜負(fù)壓環(huán)境以保證設(shè)備正常運(yùn)行使用，這就要求系統(tǒng)采用的變風(fēng)量閥有快速的反應(yīng)能力。根據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)生物安全柜變風(fēng)量閥響應(yīng)時(shí)間≤1s且房間排風(fēng)支管變風(fēng)量閥響應(yīng)時(shí)間≤3s時(shí)，不會(huì)對(duì)生物安全柜內(nèi)的負(fù)壓環(huán)境產(chǎn)生影響。同時(shí)，為了防止實(shí)驗(yàn)室房間開(kāi)關(guān)門的瞬間失壓導(dǎo)致房間壓差為零，房間各定、變風(fēng)量閥應(yīng)預(yù)設(shè)風(fēng)量偏移限制，以避免房間失壓時(shí)引起送風(fēng)量過(guò)小的情況發(fā)生。
結(jié)束語(yǔ)
從PCR實(shí)驗(yàn)室平面功能分區(qū)、試驗(yàn)室設(shè)備、人物流線、溫濕度、氣流組織、壓力控制以及典型空調(diào)原理圖進(jìn)行了設(shè)計(jì)要點(diǎn)分析，提出了PCR實(shí)驗(yàn)室按照四個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)為宜，實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的布置不僅考慮實(shí)用，同時(shí)要兼顧疏散，人物流要單向流動(dòng)，溫濕度滿足人員舒適度即可，氣流組織和壓力控制保證氣流單向流動(dòng)防止氣溶膠污染，同時(shí)在房間內(nèi)設(shè)定、變風(fēng)量閥應(yīng)對(duì)生物安全柜開(kāi)啟和關(guān)閉時(shí)房間的壓差擾動(dòng)，供PCR實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)單位和設(shè)計(jì)同行的相關(guān)人員參考。
