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技術(shù)導(dǎo)航 | PCR實(shí)驗(yàn)室建造知識與造價估算

   2020-09-14 現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室裝備網(wǎng)1001
核心提示:PCR實(shí)驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室,PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。
 

小代君說

從0開始搞懂PCR實(shí)驗(yàn)室建造

PCR實(shí)驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室,PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù),用于放大特定的DNA片段,可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng),能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量,其精確度高達(dá)納米級別,精確檢測乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復(fù)制、是否傳染、傳染性有多強(qiáng)、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗(yàn)依據(jù)。


 

PCR是分子生物學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)的常規(guī)方法,廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個領(lǐng)域,例如:艾滋病檢測、乙型肝炎、禽疫病、癌基因的檢測和診斷,DNA指紋、個體識別、親子鑒定及法醫(yī)物證,動、植物檢疫,動物及其衍生產(chǎn)品檢測,動物飼料、化妝品、食品衛(wèi)生檢測,轉(zhuǎn)基因作物與轉(zhuǎn)基因微生物檢測等。

平均每1~2年發(fā)生一次傳染病重大疫情,如2003年的重癥急性呼吸綜合征(SARS冠狀病毒),2005年的禽流感病毒(HSN1禽流感病毒), 2008年的手足口(腸道病毒),2011年的發(fā)熱伴血小板綜合征(新布尼亞病毒),2013年的流感病毒(H7N9病毒),2014年的禽流感(H10N8病毒)和埃博拉病毒,2015年禽流感病毒(H5N6病毒),2016年的塞卡病毒,以及目前的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19病毒)。疫情爆發(fā)突出表現(xiàn)為發(fā)病急、進(jìn)展快、傳染性強(qiáng),因而傳染病病原體的快速、準(zhǔn)確鑒定,成控制疫情關(guān)鍵因素。此類疾病的診斷大部分是通過核酸擴(kuò)增的方式來實(shí)現(xiàn)檢測的,而該過程均需要在高標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)室中由專業(yè)人士操作完成,因而PCR實(shí)驗(yàn)室在傳染病重大疫情防控中的疾病診斷和服務(wù)成為不可或缺的力量。除了病毒類傳染病,PCR實(shí)驗(yàn)室可開展的病原微生物檢測包括細(xì)菌類、真菌類以及原生動物等疾病的診斷,如臨床常見的巨細(xì)胞病毒、EB病毒、結(jié)核分枝桿菌、甲乙型流感病毒肺炎、支原體及衣原體感染、乙肝、丙肝、戊肝等,PCR實(shí)驗(yàn)室在疾病診斷和控制中起到極為重要的作用。


標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)室分為四個區(qū)域:試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、樣品處理區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染,進(jìn)入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行,即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)増反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進(jìn)行。


PCR實(shí)驗(yàn)室可以是分散形式,也可以是組合形式。完成一組PCR實(shí)驗(yàn),通常應(yīng)經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴(kuò)增及產(chǎn)物分析四個實(shí)驗(yàn)過程。


1、分散形式PCR實(shí)驗(yàn)室:  

所謂分散形式PCR實(shí)驗(yàn)室,是指完成上述實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房彼此相距較遠(yuǎn),呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCR驗(yàn)室,由于各個實(shí)驗(yàn)之間不易相互干擾,因此無需特殊條件要求。

 

2、組合形式PCR實(shí)驗(yàn)室:  

所謂組合形式PCR實(shí)驗(yàn)室,是指完成PCR四個實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房相鄰布置,組成獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)域的形式。對于組合形式PCR實(shí)驗(yàn)室,由于各個實(shí)驗(yàn)間集中布置,容易造成相互干擾,因此,對總體布局以及屏障系統(tǒng)具有一定的要求。各室在入口處設(shè)緩沖間,以減少室內(nèi)外空氣交換。


PCR實(shí)驗(yàn)室主要功能

1、試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)的功能是:

貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備,以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。貯存試劑和用于標(biāo)本制備的消耗品等材料應(yīng)當(dāng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū),不能經(jīng)過擴(kuò)增檢測區(qū),試劑盒中的陽性對照品及質(zhì)控品不應(yīng)當(dāng)保存在該區(qū),應(yīng)當(dāng)保存在標(biāo)本處理區(qū)。

 

2、標(biāo)本制備區(qū)的功能是:

核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管。對于涉及臨床樣本的操作,應(yīng)符合生物安全二級實(shí)驗(yàn)室防護(hù)設(shè)備、個人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染,可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件,避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染,加入待測核酸后,必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料,必須在生物安全柜內(nèi)開蓋,并有明確的樣本處理和滅活程序。

3、核酸擴(kuò)增區(qū)的功能是:

DNA合成、DNA擴(kuò)增及檢測。為避免氣溶膠所致的污染,應(yīng)當(dāng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。必須注意的是,所有經(jīng)過檢測的反應(yīng)管不得在此區(qū)域打開。

 

4、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的功能是:

擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測定,如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣,如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法(放射性核素標(biāo)記或非放射性核素標(biāo)記)、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法、質(zhì)譜分析等。

 

擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是PCR實(shí)驗(yàn)室最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源,因此應(yīng)注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時,必須使用洗板機(jī)洗板,廢液必須收集至1 mol/L HCl中,并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒,而應(yīng)當(dāng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理,如焚燒。由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等,故應(yīng)當(dāng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。

PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)主要依據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)

《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑》、《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范體外診斷試劑現(xiàn)場檢查指導(dǎo)原則》條款中,明確對PCR試劑的生產(chǎn)和檢驗(yàn)環(huán)境做出規(guī)定。此外現(xiàn)行衛(wèi)生行業(yè)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)以及相關(guān)文獻(xiàn)中對于PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室均作出規(guī)定,主要涉及《全國臨床檢驗(yàn)規(guī)程》(第三版)、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》及《臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的應(yīng)用》等行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求。

PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)要點(diǎn)

1、主體結(jié)構(gòu)

主體為潔凈彩鋼板和鋁合金型材。房間內(nèi)外角均采用鋁合金50內(nèi)圓角鋁,解決了易污染、積灰、清洗困難的問題。結(jié)構(gòu)牢固,線條簡潔美觀大方,密封性能好。

 

2、標(biāo)準(zhǔn)的三區(qū)分隔和壓差控制

將PCR過程分為試劑制備、樣品制備和PCR擴(kuò)增檢測三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)區(qū)都有一個緩沖區(qū)。

PCR實(shí)驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)及壓力控制PCR實(shí)驗(yàn)室并沒有嚴(yán)格的凈化要求,但是為避免各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性,宜采用全送全排的氣流組織形式。同時,要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。



3、消毒   

紫外線燈安裝在三個實(shí)驗(yàn)區(qū)、三個緩沖區(qū)的頂部和轉(zhuǎn)移窗內(nèi)進(jìn)行消毒。在試劑制備區(qū)和標(biāo)本制備區(qū)還設(shè)置移動式紫外線燈,對實(shí)驗(yàn)臺進(jìn)行局部消毒。

 

4、機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗

試劑和標(biāo)本通過機(jī)械聯(lián)鎖不銹鋼(不推薦電子聯(lián)鎖)傳輸窗口傳輸,確保試劑和標(biāo)本在傳輸過程中不受污染(人物分流)。

 

5、地面

地面一般采用PVC卷材地面或自流地板,整體性好。易清潔,耐腐蝕。也可以使用水磨石地面,或大瓷磚(至少800mm×800mm)接縫需要小于2mm。盡量避免產(chǎn)塵和積塵現(xiàn)象。

 

6、照明 

燈具應(yīng)選用凈化燈具,便于清潔、無塵。


PCR實(shí)驗(yàn)室主要儀器設(shè)備

1、試劑準(zhǔn)備區(qū)儀器設(shè)備主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平和離心機(jī)等,加樣器、天平除了要專用外,還應(yīng)定期校準(zhǔn)。試劑分裝應(yīng)在超凈臺中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)混合液應(yīng)使用分子生物學(xué)級的,試劑制備好后應(yīng)有質(zhì)檢:一是否有污染、二是檢測試劑的擴(kuò)增效果;

 

2、標(biāo)本制備區(qū)儀器設(shè)備主要有生物安全柜、加樣器、離心機(jī)、溫育儀、混勻器等;

 

3、擴(kuò)增區(qū)的主要儀器是核酸擴(kuò)增儀、超凈臺、微量加樣器、離心機(jī)可移動紫外燈。擴(kuò)増儀需進(jìn)行校準(zhǔn)。并配備UPS電源,以防止由于電壓的波動,停電對擴(kuò)增效果的影響。

 

4、分析區(qū)所使用的儀器設(shè)備主要有酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、加樣器和水浴箱、DNA測序儀等。

例如下圖所示:


PCR實(shí)驗(yàn)室裝修建設(shè)主要造價估價

PCR實(shí)驗(yàn)室對潔凈和恒溫恒濕有不同需求,所以一般會分為以下幾類:

1、對潔凈度沒有明確要求的PCR實(shí)驗(yàn)室整體裝修造價約2500~3000元/㎡;

2、潔凈度為十萬級的恒溫恒濕潔凈要求的PCR實(shí)驗(yàn)室整體裝修造價約3000~4000元/㎡;

 

以上估價是按以往項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的大概估價,僅供參考,其包含內(nèi)容:彩鋼板裝飾裝修、地面、電氣照明插座、紫外線滅菌、空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)、自控系統(tǒng)、實(shí)驗(yàn)家具和給排水等內(nèi)容。不含實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備、消防和環(huán)保處理部份。

 

 
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