為了達(dá)到最佳靈活性和靈敏度,我們提供5X和10X濃度的naica® multiplex PCR MIX以降低MIX用量,從而使得更多的反應(yīng)體積可供更多的模板、引物或探針的加入。
naica® multiplex PCR MIX可在naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)對多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)定量,并保持良好線性。
采用0.2到13000cp/uL的DNA樣本,使用10X naica® multiplex PCR MIX,在naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上進(jìn)行三個(gè)靶點(diǎn)的同時(shí)檢測(圖1)。高濃度的PCR MIX(5倍和10倍濃度均可使用)可使樣本輸入體積最大化,從而提高低濃度樣本中目標(biāo)靶點(diǎn)的檢測能力。
▲ 圖1:使用naica® multiplex PCR MIX同時(shí)對3個(gè)靶點(diǎn)(BRAF、ALB和pUC18)進(jìn)行線性定量。將人類基因組(hg)DNA和pUC18質(zhì)粒進(jìn)行連續(xù)稀釋(0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000cp/uL),各稀釋液進(jìn)行3次重復(fù)檢測。結(jié)果顯示各靶點(diǎn)的線性關(guān)系好,R2均大于0.99,說明結(jié)果高度真實(shí)可靠。
在多重檢測中可以對低濃度靶點(diǎn)進(jìn)行穩(wěn)定且靈敏的檢測。
多重檢測中多個(gè)靶點(diǎn)的共擴(kuò)增比單個(gè)靶點(diǎn)的擴(kuò)增更為復(fù)雜,可能會因?yàn)闈撛诘母蓴_和反應(yīng)復(fù)雜性的影響,導(dǎo)致多重檢測的線性范圍降低。在naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上使用naica® multiplex PCR MIX分別進(jìn)行3重和單重檢測(圖2),結(jié)果發(fā)現(xiàn),不管是在高濃度的外部靶點(diǎn)(BRAF和ALB hgDNA)存在的情況下(圖2A)還是在外部靶點(diǎn)不存在的情況下(圖2B),兩組實(shí)驗(yàn)中pUC18線性量化的動(dòng)態(tài)范圍一致,且陽性微滴和陰性微滴群組的熒光水平和可分性也高度一致。此外,不管是單重還是3重檢測,pUC18靶點(diǎn)都能得到可靠的定量(圖3),且檢測范圍和線性度一致。
▲ 圖2:使用naica® multiplex PCR MIX進(jìn)行的3重和單重?cái)U(kuò)增的比較。將pUC18質(zhì)粒的13000至0.2 cp/uL的系列稀釋液在2個(gè)外部擴(kuò)增靶點(diǎn)背景下(每個(gè)靶標(biāo)為3000cp/uL,圖A))和在不含外部靶點(diǎn)(圖B)的情況下進(jìn)行定量檢測,3次重復(fù)。結(jié)果顯示,3重和單重?cái)U(kuò)增中pUC18的檢測結(jié)果高度一致。注:3重和單重的反應(yīng)液中均含有pUC18、BRAF和ALB的特異性引物探針。
▲圖3:使用naica® multiplex PCR MIX的擴(kuò)增結(jié)果真實(shí)可靠。采用13000-0.2cp / uL的pUC18 DNA稀釋液進(jìn)行3重(A)和單重檢測(B),各稀釋液進(jìn)行3次重復(fù)。(A) 3重反應(yīng)中額外加入3000cp / uL(10ng)的hgDNA模板;(B) 單重反應(yīng)中沒有額外加入hgDNA模板。結(jié)果顯示,3重和單重反應(yīng)中,pUC18均能獲得真實(shí)可靠的定量結(jié)果,同時(shí)檢測范圍和線性高度一致;3重反應(yīng)中BRAF和ALB檢測也具有良好的重復(fù)性,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.3-2.5%之間,n=21。