自2000年起，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥Mp在全球各地流行的證據(jù)越來(lái)越多[6]，對(duì)臨床抗菌治療造成一定的影響。中國(guó)、日本等國(guó)家報(bào)道的部分地區(qū)Mp耐藥率已達(dá)到90%~100%[7]。重癥Mp肺炎治療挑戰(zhàn)性大，需要早診斷、早治療，實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)診斷是Mp感染診斷的關(guān)鍵。由于Mp的特殊病原學(xué)特征，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法多樣，為規(guī)范兒童Mp呼吸道感染實(shí)驗(yàn)室診斷程序，提高診斷效率，經(jīng)中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)會(huì)臨床檢驗(yàn)學(xué)組專家討論，達(dá)成并制訂兒童Mp呼吸道感染實(shí)驗(yàn)室診斷專家共識(shí)。
Mp屬于柔膜體綱，支原體屬，是能夠進(jìn)行自我復(fù)制的、有能力在體外不依靠活體細(xì)胞而生存的最小微生物[1]。Mp直徑125~150 nm，長(zhǎng)約1~2 μm，無(wú)細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜，革蘭染色陰性。因無(wú)細(xì)胞壁，Mp呈多形性，其細(xì)胞體積小于典型細(xì)菌體積的5%，能夠通過(guò)0.45 μm孔徑的細(xì)菌濾器，在營(yíng)養(yǎng)豐富的固體培養(yǎng)基（如SP4培養(yǎng)基）上生長(zhǎng)，顯微鏡下能夠看到Mp的典型菌落。Mp的基因組長(zhǎng)度約800 000 bp[8]，包含大約700個(gè)蛋白編碼基因和一些非編碼DNA序列。核糖體由30S和50S亞基組成，其基因組為環(huán)狀雙股DNA，分子量約5×108[9]。Mp較小的基因組長(zhǎng)度以及有限的生物合成能力限制了其生物合成和代謝能力，需要復(fù)雜的培養(yǎng)基添加成分才能在體外進(jìn)行分離培養(yǎng)[10]。Mp生長(zhǎng)緩慢，以二分裂方式繁殖，每6 h進(jìn)行一次分裂，有時(shí)需要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的生長(zhǎng)和（或）多次傳代才能獲得陽(yáng)性菌株。
Mp的檢測(cè)方法主要分病原學(xué)檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)兩大類，需掌握不同檢測(cè)方法的特點(diǎn)，依據(jù)不同需求和目的選擇不同方法。
一、病原學(xué)檢測(cè)
（一）培養(yǎng)法
獲取合格的呼吸道標(biāo)本，用特殊的液體培養(yǎng)基進(jìn)行3~7 d培養(yǎng)，培養(yǎng)基變色后轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至鏡下見(jiàn)到Mp典型菌落或經(jīng)基因、生化鑒定后判斷為Mp陽(yáng)性。Mp菌株生長(zhǎng)緩慢，需要經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)才出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，敏感度為34.78%，Mp培養(yǎng)陽(yáng)性的診斷特異度接近100%[11]，并能對(duì)分離株進(jìn)行種屬鑒定、分型及藥敏實(shí)驗(yàn)，具有重要的臨床意義。Mp專用培養(yǎng)基中必須含有葡萄糖作為代謝底物，同時(shí)還應(yīng)包括血清（作為膽固醇來(lái)源）、酵母提取物以及pH顯色劑。推薦使用SP4肉湯及瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行傳統(tǒng)法Mp培養(yǎng)。
目前有基于培養(yǎng)方法的快速檢測(cè)試劑盒，其方法原理是Mp利用試劑中的高營(yíng)養(yǎng)和快速生長(zhǎng)因子迅速增殖，產(chǎn)酸使試劑pH值降低，通過(guò)指示劑顏色變化來(lái)判斷Mp的存在，或進(jìn)行藥敏分析?？焖倥囵B(yǎng)Mp出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的時(shí)間較短，6~90 h不等，與Mp生長(zhǎng)傳代時(shí)間不符。有學(xué)者質(zhì)疑這種快速培養(yǎng)法的特異性，認(rèn)為導(dǎo)致培養(yǎng)基快速出現(xiàn)陽(yáng)性變色的原因是其他微生物污染而出現(xiàn)的假陽(yáng)性。如：患者帶菌或在標(biāo)本采集、運(yùn)輸、接種等過(guò)程出現(xiàn)細(xì)菌或真菌污染，而培養(yǎng)基中相應(yīng)抗菌素用量不足或含量不均勻也是導(dǎo)致細(xì)菌污染發(fā)生的因素。另外，口腔酸堿度的影響，如食物殘?jiān)?、酸性飲料等，培養(yǎng)操作過(guò)程中使用的材料、環(huán)境的酸堿度均能改變培養(yǎng)基的顏色。對(duì)臨床高度懷疑Mp感染患兒的標(biāo)本，72 h培養(yǎng)陰性者建議繼續(xù)觀察至7 d[12]，快速培養(yǎng)陽(yáng)性應(yīng)采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行病原學(xué)診斷確證。
（二）肺炎支原體的直接檢測(cè)
采用免疫雙抗夾心的方法[13]，取患者呼吸道拭子或吸取物，采用熒光、量子點(diǎn)、膠體金等標(biāo)記的鼠抗人Mp單克隆抗體，異硫氰酸熒光素或顯色物標(biāo)記的羊抗鼠抗體IgG來(lái)檢測(cè)Mp抗原，在熒光顯微鏡下觀察被特異性熒光標(biāo)記的Mp活躍性或肉眼看到顏色條帶來(lái)判斷是否感染。目前多利用高特異性地識(shí)別Mp的黏附相關(guān)P1蛋白單克隆抗體直接檢測(cè)Mp抗原，有報(bào)道特異度和敏感度為100%和97.4%[13]。此類方法方便快捷，但易受人為因素干擾，如未取到感染細(xì)胞、沒(méi)有選中合適的視野或其他病原及自身的交叉抗體干擾等，均會(huì)影響結(jié)果。
（三）分子生物學(xué)
分子生物學(xué)檢測(cè)主要有DNA和RNA檢測(cè)兩大類。該類方法具有高特異性、檢測(cè)速度快、樣本周轉(zhuǎn)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，為臨床診治提供明確依據(jù)。
1．DNA檢測(cè)技術(shù)：
基于DNA檢測(cè)技術(shù)的方法眾多，主要有熒光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）兩種，其檢測(cè)樣本為痰、鼻咽拭子、支氣管肺泡灌洗液，檢測(cè)靶標(biāo)為Mp-DNA，根據(jù)P1蛋白、16S rRNA等目標(biāo)基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。以DNA為靶標(biāo)的檢測(cè)技術(shù)靈敏度和特異性都能滿足臨床需求。但是Mp死亡后其DNA仍可存在于部分患者體內(nèi)，時(shí)間達(dá)7周~7個(gè)月，且不易降解，導(dǎo)致DNA檢驗(yàn)結(jié)果不能很好地用于治療效果的評(píng)估。
2．RNA檢測(cè)技術(shù)：
RNA檢測(cè)技術(shù)是基于核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的一種核酸檢測(cè)方法，簡(jiǎn)稱實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（simultaneous amplification and testing，SAT）。其采用的靶標(biāo)為16S rRNA，在Mp中以多拷貝形式存在（多達(dá)104拷貝量），其靈敏度和準(zhǔn)確性與DNA檢測(cè)方法相比都有很大提高[14]。由于RNA隨病原體死亡而降解，可作為評(píng)價(jià)Mp感染轉(zhuǎn)歸、藥物療效的指標(biāo)，其檢測(cè)結(jié)果與Mp的感染嚴(yán)重程度相關(guān)性較好，因此Mp的RNA檢測(cè)是目前早期快速診斷、判斷療效的最好方法之一[15]。
對(duì)于上述病原學(xué)檢測(cè)的方法，均需檢測(cè)人員嚴(yán)格掌握檢驗(yàn)前質(zhì)量，尤其是標(biāo)本采集、運(yùn)輸、保存、接種、培養(yǎng)方法及操作過(guò)程的規(guī)范，以期獲得最準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果。
二、血清學(xué)檢測(cè)
通常情況下，人體感染Mp后能產(chǎn)生IgM、IgA、IgG類抗體。IgM抗體一般在初次感染1周內(nèi)開始升高，2~3周達(dá)到高峰，4周時(shí)下降，2~3月降至最低[16]。IgA抗體在Mp感染早期迅速上升，由IgM型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生，7~14 d至峰值水平，回落比IgM或IgG更早。IgA抗體變化與IgM一致，成人Mp感染IgA陽(yáng)性率高，與IgM檢測(cè)相比，兒童IgA檢出率較低[17,18]。IgG較IgM和IgA出現(xiàn)晚，一般于感染后14 d左右出現(xiàn)，濃度峰值一般在感染后的第5周，具有較長(zhǎng)的維持時(shí)間[20]。
與病原學(xué)檢測(cè)方法比較，抗體產(chǎn)生有時(shí)間窗和個(gè)體差異，但抗體檢測(cè)結(jié)果不受抗生素治療的影響。臨床上Mp血清學(xué)診斷常用方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、顆粒凝集法（particle agglutination，PA）、免疫膠體金技術(shù)（immune colloidal gold technique，GICT）、化學(xué)發(fā)光法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）、間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunofluorescence assay，IFA）。用于抗體檢測(cè)試劑的Mp抗原選擇非常重要，它決定了檢測(cè)的敏感度和特異度。目前主要有4大類抗原，Mp全細(xì)胞裂解物（全菌體抗原）、蛋白提取物、膜制備物、糖脂提取物。Mp全菌體抗原包括細(xì)胞膜的糖脂、蛋白質(zhì)等成分，特異度和敏感度較差，與人體多種組織細(xì)胞膜、某些細(xì)菌（如流感嗜血桿菌、奈瑟腦膜炎球菌等）以及其他支原體都會(huì)出現(xiàn)非特異性交叉反應(yīng)；黏附相關(guān)蛋白，如P1蛋白、P30蛋白、P116蛋白、重組AtpD蛋白、重組P1-C蛋白等是重要的免疫原，尤其P1蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，是Mp診斷的重要抗原，重組P1蛋白的特異度和敏感度可以達(dá)到97.7%和85.0%[16]。
下面介紹各類血清學(xué)檢測(cè)方法的特點(diǎn)。
（一）ELISA
ELISA作為實(shí)驗(yàn)室常用的雙抗體夾心法，利用其基本原理檢測(cè)人血清中Mp的IgM、IgG、IgA各類型抗體，具有較高的敏感度和特異度，其包被的Mp抗原來(lái)源多樣，建議選擇敏感度和特異度均較高的抗原包被試劑盒檢測(cè)。
（二）PA
PA的原理是將Mp細(xì)胞膜（可溶性抗原）致敏或吸附在一定大小的顆粒狀載體的表面，與人血清中存在的Mp抗體結(jié)合后，在有電介質(zhì)存在的適宜條件下，可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應(yīng)。目前常用作載體的顆?；蛭⑶蚨酁槿斯ず铣苫蛱烊桓叻肿硬牧现瞥傻?，如明膠顆粒、聚苯乙烯膠乳微球等。由于載體顆粒增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積，當(dāng)顆粒上的抗原與微量抗體結(jié)合后，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。該方法檢測(cè)有效性的指標(biāo)是試劑盒內(nèi)提供的陽(yáng)性對(duì)照滴度達(dá)到1∶320，抗體滴度檢測(cè)范圍為1∶40~1∶10 240?；颊哐錗p抗體滴度≥1∶160作為Mp近期或急性感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)；恢復(fù)期和急性期Mp抗體滴度呈4倍及以上增高或減低時(shí)，可確診Mp感染[18,20]。PA檢測(cè)Mp總抗體，方法重復(fù)性好，特異度、敏感度佳，治療前后雙份血清滴度的變化更有利于診斷。
（三）GICT
GICT是一種以新型的免疫標(biāo)記——膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用抗原抗體特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)原理檢測(cè)Mp抗體，主要有免疫層析法和免疫滲濾法?；驹硎欠磻?yīng)板上的Mp抗原可與待測(cè)樣本中Mp抗體結(jié)合，再與膠體金標(biāo)記的抗人IgM抗體結(jié)合并顯色，形成肉眼可見(jiàn)的紅色斑點(diǎn)或條帶判斷陽(yáng)性。GICT檢測(cè)Mp的IgM抗體，研究顯示兒童MP-IgM陽(yáng)性與PA滴度1∶160和≥1∶320的符合率均為95%；單次測(cè)定Mp-IgM陽(yáng)性對(duì)診斷兒童Mp近期感染有價(jià)值，適合門診的快速檢測(cè)[21]。目前是定性試驗(yàn)，患者抗體含量較低時(shí)可能造成漏檢，且抗體在部分治愈患者體內(nèi)持續(xù)存在，使得對(duì)短期內(nèi)再次感染的陽(yáng)性判斷造成困擾。
（四）CLIA
CLIA的原理是將發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記在Mp抗原上，或免疫復(fù)合物上的酶作用于發(fā)光底物，通過(guò)大型發(fā)光儀測(cè)量光量子產(chǎn)額，定量、成批地檢測(cè)Mp的IgM、IgG，目前此方法的應(yīng)用、與常用抗體檢測(cè)方法的比對(duì)研究較少，需進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)。
（五）IFA
IFA的原理是用標(biāo)本血清和已知的Mp抗原相互作用，經(jīng)溫育后洗滌。若待檢測(cè)標(biāo)本中含有相應(yīng)抗體，則與Mp抗原發(fā)生特異性結(jié)合且不會(huì)被洗掉，與標(biāo)記有熒光素的抗球蛋白抗體結(jié)合，在顯微鏡下觀察綠色熒光。該方法主要檢測(cè)Mp IgM抗體，特異度和敏感度較好，具有對(duì)照明顯、結(jié)果判讀和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[16]。但該實(shí)驗(yàn)易受人為判斷熒光結(jié)果影響，包被抗原含量不足可能會(huì)產(chǎn)生假陰性，體內(nèi)含有類風(fēng)濕因子、多種自身免疫性抗體等與包被抗原有交叉反應(yīng)可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。
（六）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complement fixation assay，CFA）
CFA的原理是利用Mp抗原抗體反應(yīng)消耗補(bǔ)體從而使補(bǔ)體參與指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)的濃度降低或消失。CFA檢測(cè)抗Mp的總抗體，一般認(rèn)為滴度>1∶64或恢復(fù)期血清呈4倍以上升高有診斷意義。與其他檢測(cè)方法相比，CFA采用糖脂抗原，特異性較差，操作過(guò)程中存在較多干擾，目前已經(jīng)很少用于Mp臨床診斷。
（七）冷凝集試驗(yàn)（cold agalutination test，CAT）
多年前CAT應(yīng)用于Mp感染的實(shí)驗(yàn)室診斷，血清冷凝集素在感染1周開始升高，4周達(dá)高峰，第6周下降或者消失，紅細(xì)胞CAT陽(yáng)性，效價(jià)大于1∶32，恢復(fù)期效價(jià)增加4倍有診斷意義。但冷凝集素增高也可見(jiàn)于其他疾病，如流行性感冒、傳染性單核細(xì)胞增多癥、風(fēng)疹等，故CAT的特異性差，現(xiàn)已逐漸被其他Mp的檢測(cè)方法取代。
（八）實(shí)驗(yàn)室Mp血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果的判讀
1．顆粒凝集試驗(yàn)抗體滴度≥1∶160：
提示近期或現(xiàn)癥感染。
2．只有IgM抗體（+）：
提示近期感染。
3．只有IgM及IgA（+）：
提示現(xiàn)癥感染。
4．只有IgG抗體（+）：
提示既往感染。
5．IgM、IgG及l(fā)gA均為（+）/IgM及IgG（+）/lgA及l(fā)gG（+）：
提示現(xiàn)癥感染或近期感染。
6．間隔2~4周雙份血清抗體亞型轉(zhuǎn)化/血清抗體水平4倍及以上增加或降低：
確診Mp感染。
評(píng)價(jià)血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果時(shí)需要結(jié)合患者的臨床病程、基礎(chǔ)狀況以及年齡等因素綜合考慮，如：免疫功能低下、缺陷的人群、產(chǎn)生抗體能力較低的嬰幼兒，可能不產(chǎn)生或產(chǎn)生低滴度的抗體[22,23]?？贵w在部分治愈患者體內(nèi)會(huì)持續(xù)陽(yáng)性，期間再次感染的確診應(yīng)做Mp的抗體滴度或RNA檢測(cè)以佐證。
三、藥敏試驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè)
因Mp培養(yǎng)條件要求苛刻，生長(zhǎng)緩慢，不推薦臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)做體外藥物敏感性試驗(yàn)。美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI）2011年頒布了支原體體外藥敏測(cè)定即M43-A指南9，可用于Mp耐藥流行病學(xué)調(diào)查和分析[24]。指南推薦微量稀釋法測(cè)定Mp最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），其敏感/耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)（MIC值）：左氧氟沙星≤1 mg/L，莫西沙星、紅霉素及阿奇霉素≤0.5 mg/ L，四環(huán)素≤2 mg/L為敏感；紅霉素及阿奇霉素>1 mg/L為耐藥[10]，質(zhì)控菌株為肺炎支原體FH（ATCC15531）。
Mp重癥感染合并多種肺外并發(fā)癥且藥物治療不佳的病例報(bào)道日漸增多。有研究顯示，23S rRNA結(jié)構(gòu)域Ⅱ區(qū)和Ⅴ區(qū)基因位點(diǎn)突變可導(dǎo)致抗生素與核糖體親和力下降而引起耐藥，基因突變導(dǎo)致的藥物結(jié)合靶點(diǎn)改變是Mp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的最重要原因[25]，結(jié)構(gòu)域Ⅴ區(qū)A2063G、A2064G突變導(dǎo)致高水平耐藥，A2067G、C2617G突變發(fā)生低水平耐藥[26]。臨床上可以參考Mp 23S rRNA基因突變位點(diǎn)進(jìn)行耐藥分析[27]。
四、肺炎支原體檢測(cè)的質(zhì)量控制
Mp檢測(cè)的質(zhì)量控制是獲得準(zhǔn)確可靠結(jié)果的前提，檢驗(yàn)的質(zhì)量控制從檢驗(yàn)前、中、后質(zhì)量控制三部分闡述。
（一）檢驗(yàn)前質(zhì)量控制
檢驗(yàn)前質(zhì)量控制主要是樣本采集、運(yùn)輸、保存過(guò)程的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)作為重點(diǎn)培訓(xùn)和規(guī)范內(nèi)容推廣。
病原學(xué)檢測(cè)標(biāo)本采集盡可能采集多種類型的標(biāo)本和（或）連續(xù)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集不同部位的標(biāo)本，以滿足最低檢測(cè)閾值采集量、陽(yáng)性率和多種檢測(cè)方法聯(lián)合檢測(cè)的需求。咽、鼻、喉拭子最易獲得，痰液需判斷是否合格，肺泡灌洗液的雜菌污染較少，不同標(biāo)本的病原學(xué)檢測(cè)靈敏度和特異性研究報(bào)道不一致，40%~80%不等[28,29]，晨痰對(duì)呼吸道支原體的檢測(cè)價(jià)值較高，可依據(jù)臨床實(shí)際情況選擇，具體操作規(guī)范見(jiàn)表1。用做核酸檢測(cè)的樣本容器不可含核酸酶，以防止核酸降解；容器內(nèi)應(yīng)預(yù)裝具有防核酸降解功能的保存液，有利于標(biāo)本保存和轉(zhuǎn)運(yùn)。呼吸道標(biāo)本室溫下30 min內(nèi)送檢，4 ℃環(huán)境下2~4 h內(nèi)送檢，標(biāo)本4 ℃保存不應(yīng)超過(guò)48 h，預(yù)計(jì)延遲送檢的標(biāo)本應(yīng)在－70 ℃條件下保存[30]。血液應(yīng)盡可能采集急性期和至少間隔2周的恢復(fù)期雙份血清。
表1 樣本采集、運(yùn)輸、保存規(guī)范表
（二）檢驗(yàn)中質(zhì)量控制
檢驗(yàn)中質(zhì)量控制主要包括檢測(cè)方法的選擇、性能驗(yàn)證、室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評(píng)四方面。
1．檢測(cè)方法的選擇：
鑒于Mp獨(dú)特的病原學(xué)特點(diǎn)、病原學(xué)檢測(cè)的合格取材問(wèn)題、血清學(xué)檢測(cè)的時(shí)間窗和機(jī)體免疫條件影響以及不同檢測(cè)方法的敏感度、特異度的不同，采用一種檢測(cè)方法無(wú)法達(dá)到最終確診，因此病原學(xué)與血清學(xué)聯(lián)合診斷仍然是目前提倡的Mp感染診斷策略[11]。本共識(shí)給出分等級(jí)推薦的檢測(cè)方法，應(yīng)用時(shí)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的優(yōu)劣勢(shì)、貢獻(xiàn)度和實(shí)驗(yàn)室能力選擇。
一級(jí)推薦方法：Mp病原學(xué)采用分子生物學(xué)RNA檢測(cè)；Mp血清學(xué)檢測(cè)方法采用顆粒凝集法抗體滴度測(cè)定。
二級(jí)推薦方法：Mp病原學(xué)采用分子生物學(xué)DNA檢測(cè)；Mp血清學(xué)檢測(cè)方法采用ELISA抗體分型檢測(cè)。
三級(jí)推薦方法：Mp病原學(xué)采用培養(yǎng)法或直接檢測(cè)法；Mp血清學(xué)檢測(cè)方法采用間接免疫熒光法、免疫膠體金法；非特異性血清學(xué)檢測(cè)方法。
一級(jí)為最佳方法，陽(yáng)性可確診Mp感染，三級(jí)推薦方法中的Mp直接檢測(cè)法和GICT對(duì)門急診患者M(jìn)p感染診斷的快速初篩是有價(jià)值的，進(jìn)一步診斷需一級(jí)、二級(jí)推薦方法的確認(rèn)或動(dòng)態(tài)復(fù)檢。建議有能力的實(shí)驗(yàn)室開展一級(jí)、二級(jí)推薦方法，病原學(xué)培養(yǎng)法雖不作為常規(guī)臨床診斷推薦方法，但其真陽(yáng)性可確診Mp感染，分離株對(duì)進(jìn)行種屬鑒定、耐藥基因檢測(cè)及藥敏實(shí)驗(yàn)具有重要的臨床意義。CLIA因應(yīng)用不廣泛，暫不列入推薦等級(jí)。
目前國(guó)內(nèi)關(guān)于Mp檢測(cè)的各類試劑盒生產(chǎn)廠家眾多，抗原、抗體選擇不同，方法的敏感度和特異度不同，使判斷結(jié)果存在差異，因此實(shí)驗(yàn)室應(yīng)至少開展兩種及以上不同的檢測(cè)方法以彌補(bǔ)相互之不足，并且同一類檢測(cè)方法應(yīng)進(jìn)行兩種及以上試劑的比對(duì)試驗(yàn)，選取結(jié)果更好的作為最終使用試劑。
2．檢測(cè)方法的性能驗(yàn)證：
Mp的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目均需開展性能驗(yàn)證，即是檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的保證，也是ISO15189對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室的要求。血清學(xué)項(xiàng)目的檢測(cè)應(yīng)按照定性檢測(cè)項(xiàng)目的性能驗(yàn)證指南進(jìn)行，分子診斷方法的檢測(cè)按照分子生物學(xué)檢測(cè)方法的性能驗(yàn)證指南進(jìn)行。
3．室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)：
按照ISO15189對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室的要求，Mp所有檢測(cè)項(xiàng)目需要開展室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)。
室內(nèi)質(zhì)控物的選擇：陰、陽(yáng)性質(zhì)控物為外部對(duì)照，用于監(jiān)控實(shí)驗(yàn)的有效性，實(shí)驗(yàn)室在選擇時(shí)應(yīng)考慮類型（宜選擇人血清基質(zhì)，避免工程菌或動(dòng)物源性等的基質(zhì)）、濃度（弱陽(yáng)性質(zhì)控物濃度宜在2~4倍臨界值左右，陰性質(zhì)控物濃度宜在0.5倍臨界值左右）、穩(wěn)定性（宜選擇生產(chǎn)者聲明在一定保存條件下2~8 ℃或-20 ℃以下，有效期為6個(gè)月以上）、均一性。
室內(nèi)質(zhì)控頻率：每檢測(cè)日或分析批，應(yīng)使用弱陽(yáng)性和陰性質(zhì)控物進(jìn)行質(zhì)控。
室內(nèi)質(zhì)控物位置：不能固定而應(yīng)隨機(jī)放置且應(yīng)覆蓋檢測(cè)孔位（標(biāo)本間隔）。
室內(nèi)質(zhì)控評(píng)定規(guī)則：肉眼判斷：陰性、陽(yáng)性質(zhì)控物的檢測(cè)結(jié)果分別為陰性、陽(yáng)性即在控；滴度判斷：陰性質(zhì)控物必須陰性，陽(yáng)性質(zhì)控物結(jié)果在上下1個(gè)滴度內(nèi)為在控。
判斷規(guī)則：根據(jù)不同項(xiàng)目可以采用肉眼判斷的規(guī)則，也可采用統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控規(guī)則，至少利用一個(gè)偶然誤差及一個(gè)系統(tǒng)誤差規(guī)則。
室間質(zhì)評(píng)：目前，國(guó)家及省市級(jí)臨檢中心尚未開展針對(duì)Mp項(xiàng)目的室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃。因此，Mp檢驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)采用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的方式進(jìn)行評(píng)價(jià)，比對(duì)實(shí)驗(yàn)應(yīng)滿足如下要求：（1）規(guī)定比對(duì)實(shí)驗(yàn)的選擇原則；（2）樣本數(shù)量：至少5份，包括陰性和陽(yáng)性；（3）頻率：至少每年2次；（4）判定標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)有≥80%的結(jié)果符合要求；（5）結(jié)果不一致時(shí)，應(yīng)分析不一致的原因，必要時(shí)，采取有效的糾正措施，并定期評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)對(duì)其質(zhì)量的改進(jìn)作用，保留相應(yīng)的記錄。
（三）檢驗(yàn)后質(zhì)量控制
檢驗(yàn)后質(zhì)量控制主要是檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量的保證、檢驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告和發(fā)布，一個(gè)實(shí)驗(yàn)室具備多種檢驗(yàn)方法時(shí)，要注意報(bào)告發(fā)出時(shí)的邏輯性。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果不相符時(shí)，應(yīng)查找檢驗(yàn)前、中的質(zhì)量問(wèn)題；排除檢測(cè)導(dǎo)致的假陰性和假陽(yáng)性后，分析如下。
1．雙陽(yáng)性結(jié)果：
血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性：基本可確診為Mp感染。此類患者，發(fā)病時(shí)間多超過(guò)一周，抗體已經(jīng)產(chǎn)生，后期進(jìn)行療效觀察時(shí)可采用RNA檢測(cè)。
2．單陽(yáng)性結(jié)果：
血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果陰性，分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性：基本可確診為Mp早期感染。其一，發(fā)病時(shí)間較短，抗體尚未產(chǎn)生；其二，免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善、免疫功能低下，未產(chǎn)生抗體或抗體滴度較低?？贵w效價(jià)4倍變化可進(jìn)一步確證Mp感染。
血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果陰性：需依據(jù)抗體陽(yáng)性類型和滴度來(lái)判斷Mp的現(xiàn)癥或既往感染，多為治療后的既往感染。
3．雙陰性結(jié)果：
血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果均陰性，Mp感染的可能性很小，需要進(jìn)一步鑒別診斷時(shí)可監(jiān)測(cè)抗體滴度或重新采樣。
五、兒童Mp呼吸道感染實(shí)驗(yàn)室診斷共識(shí)的意義
本共識(shí)規(guī)范了兒童呼吸道Mp感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法的類型、概念和價(jià)值，旨在根據(jù)患者現(xiàn)癥和既往、門診和住院、篩查和確診等不同的感染情況選擇不同的檢測(cè)方法，結(jié)合患者臨床癥狀、體征以及胸片等其他輔助檢查，同時(shí)對(duì)患者年齡、全身狀況、用藥、病程等綜合判斷，為臨床Mp感染的診斷提供合理、經(jīng)濟(jì)、高效的參考建議。經(jīng)歸納總結(jié)形成Mp實(shí)驗(yàn)室診斷流程圖，見(jiàn)圖1。
圖1 Mp呼吸道感染實(shí)驗(yàn)室診斷流程圖
