Zymolyase-100T From Arthrobacter luteus
酵母裂解酶-100T來自藤黃節(jié)桿菌
-----MP Biomedicals New Zealand Limited
簡述:
Zymolyase-20T(酵母裂解酶-20T)是通過Arthrobacter luteus(藤黃節(jié)桿菌)深層培養(yǎng)獲得的酶制劑,它能有效的裂解活酵母細胞細胞壁。該制劑是利用親和層析法部分純化獲得的凍干酶,其酶活單位是100,000 單位/g.其中主要負責裂解活酵母細胞的酶成分是ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶,通過對ß-1,3-葡聚糖連接位水解葡萄糖聚合物,釋放產(chǎn)物主要是昆布五糖。
產(chǎn)品說明:
單位定義:800nm條件下菌液吸光度下降30%,表示一個活力單位。
特異性:此產(chǎn)品的裂解譜包括以下屬的生物:Ashbya, Candida, Debaryomyces, Eremothecium, Endomyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kloekera, Kluyveromyces, Lipomyces, Metschikowia, Pichia, Pullularia, Torulopsis, Saccharomyces, Saccharomcopsis, Saccharomycodes, Schwannimomyces and others.
用途:可用于細胞裂解、原生質(zhì)球形成及葡聚糖水解。
說明:酵母細胞的裂解程度隨酵母菌的種類、生長階段及培養(yǎng)條件而改變。
聲明: Zymolyase是麒麟麥酒股份有限公司(Kirin Brewery Co., Ltd)的注冊商標。
儲存:凍干狀態(tài)于2-8°C中保存,若30°C下放置3個月約失去90%活力。
外觀:凍干粉
活力:100,000單位/g
核心酶:ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶
其他酶: ß-1,3-葡聚糖酶,約1.0 x 107 單位 /g
蛋白酶,約1.7 x 104單位 /g
甘露聚糖酶, 約6.0 x 104單位 /g
淀粉酶,木聚糖酶,***酶,微量DNase及Rnase(未檢出)
催化劑:二硫蘇糖醇(DTT), ß-巰基乙醇及其他的巰基化合物(如半胱氨酸)
最適pH及溫度:
pH 7.5, 35°C裂解活酵母細胞
pH 6.5, 45°C水解酵母葡聚糖
pH范圍:pH 5-10間保持穩(wěn)定
熱穩(wěn)定性:60°C,5min喪失細胞溶解能力
警告:(1)ZymolaseØ-100T溶解度低,以懸浮液的狀態(tài)使用。如果需制備濃度超過0.05%的無菌酶溶液,則通過將ZymolaseØ-100T溶解在含5%葡萄糖的緩沖液中(pH 7.5),首先配制2%的酶儲存液;(2)吸取懸浮液,留下沉至容器管底的任何物質(zhì);(3)不推薦使用**纖維過濾器;(4)稀釋無菌的酶懸浮液至目標濃度。
原生質(zhì)球制備程序:
1. 室溫條件,5000rpm(3000 xg),5min離心酵母培養(yǎng)物;
2. 收集離心沉淀物(酵母細胞)并記錄濕重;
3. 用TE緩沖液懸浮細胞,加入量為1.4ml/g濕重細胞;(TE緩沖液配方:100 mM Tris [MP 8196231],pH 8.0,100 mM EDTA [MP195173])
4. 雙蒸水快速定容,終體積量為3.5ml/g濕重細胞;
5. 按照17.5 ul (總體積的1/200)/ g濕重細胞的量加入ß -巰基乙醇(MP 806445),目的是為了除去細胞外層中的甘露聚糖層;
6. 30°C輕搖溫育混合液,處于對數(shù)期生長的培養(yǎng)物處理15min,處于穩(wěn)定期生長的培養(yǎng)物處理45min;
7. 室溫條件,5000rpm離心5min;
8. 用S緩沖液重新懸浮細胞,加入量為4.0ml/g濕重細胞;(S緩沖液配方:1.0 M 山梨糖[MP 102938],10 mM PIPES (MP 190257), pH 6.5)
9. 5000rpm離心5min;
10. 再次用S緩沖液(4.0ml/g濕重細胞)懸浮細胞,另外加入Zymolyases(50U /g濕重細胞);如果Zymolyases配制成附錄所示的溶液,則添加250ul即可。最好根據(jù)實驗情況最先優(yōu)化酶使用量。
11. 30°C輕搖溫育混合液30min,根據(jù)以下方式監(jiān)測原生質(zhì)球形成程度:
(1) 加1ul樣品到20ul S 緩沖液內(nèi),原生質(zhì)球應(yīng)該保持完整;
(2) 加1ul樣品到20ul雙蒸水中,原生質(zhì)球應(yīng)該破裂;顯微鏡下觀察比較兩個樣品的形態(tài)差異。
12.一般情況下反應(yīng)45-60min,原生質(zhì)球的形成量>90%,此時4oC下離心收集細胞,5000rpm,5min;
13. 再次用S緩沖液(2 ml/g濕重細胞)懸浮原生質(zhì)球,5000rpm離心5min;重復此步驟做第二次清洗;;
14.原生質(zhì)球離心沉淀物-70oC凍存。
裂解原生質(zhì)球獲取細胞核:
溫和的裂解原生質(zhì)球方法如下; 用3倍體積的18%Ficoll(MP 160003)溶液懸浮細胞離心沉淀物,F(xiàn)icoll溶解于含有0.5 mM CaCl2 (MP 195088)的10 mM PIPES 緩沖液內(nèi),pH 6.5。
酵母菌基因組DNA的制備:
以下步驟快捷,適合于從少量酵母培養(yǎng)物中制備基因組DNA :
1. 將過夜培養(yǎng)的10ml酵母菌培養(yǎng)物離心收集細胞,加入280ul TE Buffer(配方見原生質(zhì)球制備程序中的步驟3),300 ul雙蒸水,3 ul ß -巰基乙醇(MP 806445);
2. 30oC溫育45min;
3. 以臺式離心機的最高速度離心2-3s,棄上清液,沉淀物用500 ul S 緩沖液(配方見原生質(zhì)球制備程序中的步驟8)懸浮.;再次離心棄上清;
4. 用500 ul含有1 mg/ml Zymolyase 20T(MP 32-092-1)的S緩沖液懸浮細胞沉淀物(或者使用自己認為最合適的酶濃度);
5. 30oC溫育1小時;
6. 重復步驟3;
7. 用200 ul含有0.1%SDS(MP 190522)和2ug蛋白酶K (MP 809252)的TE 緩沖液懸浮細胞沉淀物;
8. 37oC溫育3小時,不時的混勻溶液;
9. 調(diào)水浴鍋的溫度至65oC,并溫育20min;
10. 從水浴鍋內(nèi)取出并冷卻至室溫;
11. 用200ul 1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液萃取,漩渦混勻并離心;從離心機內(nèi)取出并保留上清液;
12. 用200ul氯仿萃取上清液,之后重復漩渦混勻及離心;
13. 加入500ul95%乙醇到上清液內(nèi),20oC沉淀10min;
14. 4oC下,15,000 xg離心20 min;
15. 自然風干或者于真空離心蒸發(fā)濃縮器內(nèi)晾干除去多余的乙醇,并加入200ul TE緩沖液(含有150 mM NaCl和1 ug核糖核酸酶A (MP 101076))溶解DNA;
16. 37oC溫育1小時;
17. 重復步驟11和12;
18. 加入2.5倍體積的95%乙醇,20oC沉淀10min;
19. 30ul雙蒸水重懸DNA。對1:500的DNA稀釋液測量A260,根據(jù)消光系數(shù)計算DNA產(chǎn)量;
20. 產(chǎn)量大約為40-50ug。
附錄:
制備Zymolyase 100T溶液:
以下配制的溶液適用于該產(chǎn)品的實驗程序中(但并不排除其他類型的母液也適用)
配制200單位/ml的母液,將凍干粉溶于已高壓滅菌的S緩沖液(配方見原生質(zhì)球制備程序中的步驟8)。
如果不被微生物污染,于4 oC下,此母液能2個星期以上時間內(nèi)保持高效;
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08320921 320921 Zymolyase 20T 1 g 5390.00
08320931 320931 ZYMOLYASE 100T 500 mg 16128.00
08320932 320932 ZYMOLYASE 100T 250 mg 9898.00
廠家說明:
MP Biomedicals生物醫(yī)學公司是位于美國加利福尼亞州的知名生命科學和生物技術(shù)廠商。2004年底成功收購Qbiogene、ICN,現(xiàn)在全球有5個大型倉庫,能夠及時供應(yīng)各行業(yè)需求,亞洲倉庫位于新加坡。它致力于生命科學領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和探索。目前它提供55000多種產(chǎn)品,是世界上能全面提供生命科學產(chǎn)品和臨床診斷產(chǎn)品的幾家廠商之一。
北京畢特博生物技術(shù)有限責任公司是此美國MPBIO的代理商,同時經(jīng)營此品牌已有幾年的歷史了。
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